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中药肝毒性研究方法技术的新进展及其应用
宋捷1,2，钟荣玲1，夏智1，吴豪1，仲青香1，张振海1，韦英杰1，石子琪1，封亮1*，贾晓斌1*
（1.江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏南京；
2.南京中医药大学，江苏南京）
肝脏是人体最大的“加工厂”，承担着生物合成、代谢转化以及分泌排泄等重要功能。药物进入体循环后，将经过肝脏代谢，因此肝脏是药源性损伤的主要靶器官之一。医院王贵强教授指出，40.3%的药物性肝损伤为中草药所致。何首乌、菊三七、补骨脂、番泻叶、大黄等临床常用中药都已经被证实具有一定的肝毒性，重视中药肝毒性已是当务之急。
版《中国药典》一部收载了中药材及饮片种，其中标有毒性的只有83种，其中大毒10种，有毒42种，小毒31种。值得注意的是，本草古籍中提到的“毒”几乎全部指的是急性毒性；古人对于药物的慢性毒性认识，是一个薄弱环节，不过这也是由时代的局限性所导致的。现阶段临床上治疗心脑血管疾病和骨质疏松等疾病的中成药都需要长期服药，这势必对中药的安全性评价提出了更高的要求。因此，有必要对部分典型中药的安全性进行再评价，对中药的急性毒性、亚慢性毒性以及长期毒性有一个更为客观和科学的认识，明确其临床使用的安全窗；建立符合中医药特点的毒性评价体系，为中药的临床用药提供参考。
传统的毒理学研究通常以动物模型作为基础，实验周期较长，成本颇高。国际上常规的毒理学研究终点均因灵敏性、稳定性和特异性较差无法成为肝毒性早期诊断的标准。现有的临床前体外实验和体内实验的整体毒性预测率只有71%，有近30%的药物毒性是现有的临床前实验方法无法预测的。而随着分子生物学和现代分析技术的发展，越来越多的新技术和新模型已用于肝毒性的研究中，如干细胞诱导分化的肝细胞及亚细胞模型（快速、经济、直观地反映出药物对细胞及细胞器的影响）；斑马鱼模型（检测药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄过程）；三维培养模型（模拟肝脏细胞的空间结构并维持代谢酶的活性），毒理基因组学，毒理蛋白质组学（利用基因芯片和质谱联用技术找出新的生物标记物，构建肝毒性数据库），以上肝毒性检测手段的涌现极大的丰富了中药肝毒性评价体系的内涵，有助于进一步揭示中药肝毒性的机制，从而实现中药肝毒性的早期预警。鉴于此，笔者将针对近5年来国内外肝毒性研究体系的进展进行综述和分析。
1中药肝毒性评价的新模型及其应用
1.1常见的肝毒性评价细胞模型
常见的肝毒性筛选细胞系主要有人原代肝细胞、HepG2、L-02、hiHeps、HepaRG细胞系等（表1）。HepG2细胞是最具有代表性和最常用的细胞系，细胞表面表达有有丰富的IGFII受体，但是在标准培养条件下，细胞中功能性CYP酶活很低，几乎检测不到。赵筱萍等采用二乙酸荧光素荧光标记法在HepG2细胞模型上筛选木香中的肝毒性组分，结合GC/MS联用技术，发现木香中所含的去氢木香内酯、珊塔玛内酯、瑞诺木烯内酯、α-木香醇和榄香醇具有一定的肝毒性；L-02细胞是一种正常人胚胎肝细胞，能够传代培养，常用作化合物肝脏毒性的体外研究模型。Lin等通过测定L-02细胞的活力，LDH渗漏率，酶活力，并结合UPLC-Q-TOF/MS技术，辨析出何首乌的肝毒性主要和蒽醌类以及大黄素等密切相关；hiHeps细胞是由人胚胎成纤维细胞分化而来，CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9等代谢酶的活力和新鲜分离的肝原代细胞接近；HepaRG细胞由人肝脏细胞分化而来，兼具肝细胞和胆管上皮细胞的特性，功能酶（CYP酶，内质网酶，ABC转运蛋白）相对完整，具有双向分化能力。吴宇等运用6种联合探针标记HepaRG细胞，双氯芬酸钠，盐酸丁螺环酮等药物的毒性充分体现，氧化应激、线粒体损伤、内质网应激以及钙稳态等指标的灵敏度也高于hiHeps、HepG2和L-02细胞，提示HepaRG可作为高内涵细胞组学体外模型进行药物肝毒性筛选。
1.2干细胞诱导分化的肝细胞模型
1.2.1人胚胎干细胞模型
由人胚胎干细胞诱导分化的肝细胞（humanembryonicstemcell-derivedhepatocytes,hESC-Hep）建立的肝毒性评价体系，具有实验周期短、用药量少和有效避免种属差异等优点。hESC诱导分化3周即形成均一的、纯度较高的肝样细胞，具有肝细胞典型的形态结构并且可以检测到CYP酶、有机阴离子转运多肽1B1、消除转运蛋白BSEP以及肝细胞特异性蛋白，如胞内酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和分泌白蛋白等的表达-。目前，该技术仅被少数实验室掌握，价格不菲，但其为肝毒性评价体系的完善提供了一个全新的方向。
1.2.2人多潜能干细胞模型
诱导人多潜能干细胞分化成肝细胞（humaninducedpluripotentstemcells-derivedhepatocytes,hiPSC-Hep），用凝胶固定培养，并将其与鼠胚胎成纤维细胞（3T3-2）、基质胶共培养建立微型图像化共培养平台(iMPCC)，该体系可促进hiPSC-Hep的成熟并使其寿命延长至4周。hiPSC-Hep可应用于肝毒性的预测以及肝极性、白蛋白含量、P酶活的检测。Sullivan团队诱导hiPSCs分化出具有肝脏功能的人肝内胚层，发现其可以用于药物毒性的筛选，以及CYP1A2和CYP3A4酶活的研究。Takayama等建立了hiPSC-Hep的三维球体培养体系（3DhiPSC-Hep），采用WST-8法检测肝毒性药物对细胞活力的影响，氯氮平、硝苯呋海因、他克林等药物作用后，3DhiPSC-Hep组的细胞活力均明显低于3DHepG2组，提示该模型的灵敏度要优于3DHepG2模型，更适用于肝毒性的早期筛选。
1.3亚细胞---高内涵分析
细胞经毒物作用受损或死亡时，其内部则表现为细胞器的损伤或病变，如线粒体、溶酶体、内质网等细胞器的损伤。荧光成像技术和高内涵分析（HighContentAnalysis，HCA）在亚细胞水平的筛选中应用日益广泛。目前HCA能够实时、动态监测体外肝细胞毒性的多个参数、毒理学机制相关的多个重要的标志分子，主要包括细胞及亚细胞形态与数量、线粒体膜电位、氧化应激及DNA损伤，是评估和预测候选药物肝毒性的高效手段。Fu等利用分离的大鼠线粒体和雷公藤甲素（Triptolide，TP）共同孵育，发现TP可浓度依赖性的诱导线粒体的肿胀，增加线粒体渗透性，最终导致线粒体损伤。Wang等运用四种探针（罗丹明，Hoechst，碘化丙啶，Mitotracker）联合标记HepG2细胞，研究四种中药注射液的肝毒性。使用HCA技术以及荧光显微成像快速、敏感、高效的区分出了一种可能引起线粒体损伤的中药注射液（Fufangkushen），所得结论和小鼠的亚急性毒性试验结果一致。肖小河团队采用HCA二重探针标记法，检测何首乌与茯苓、甘草、三七在肝窦内皮细胞上的配伍减毒情况。研究发现何首乌对肝窦内皮细胞的损伤呈剂量依赖性，分别配伍不同浓度的茯苓、甘草、三七都有显著的减毒作用。其中，何首乌配伍茯苓减毒的效果较好，甘草次之，三七稍差。
1.4三维培养模型
1.4.1精密肝切片
精密肝切片（precision-cutliverslice,PCLS）技术是介于器官与细胞水平之间的体外培养技术，可包含肝组织内的所有类型的细胞，维持了肝腺泡功能和结构的完整性，在生化和生理功能上与活体肝相似，近年来已应用于肝毒性的研究。PCLS模型可以在早期快速、高效的识别药物改变脂质代谢以及胆汁酸淤积的机制。Mukazayire等使用PCLS模型简单、快速的区分出了三种致肝毒性的卢旺达草药，提示PCLS可用于大样本的肝毒性筛选研究。Vatakuti等通过大鼠PCLS技术研究了四氯化碳的肝毒性，运用微阵列分析监测mRNA的早期变化、转基因组学实验测定α-B晶状蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达，最终发现了四氯化碳诱导肝纤维化的早期标志物。回连强等将不同浓度的野百合碱与肝切片共同孵育24h后，乳酸脱氢酶（LDH）的含量显著上升，蛋白水平下降，表明野百合碱会诱发一定的肝毒性。Szalowska等-对具有潜在肝毒性药物进行了筛选，用四环素、丙戊酸、碘胺酮与小鼠PCLS共同孵育，经DNA微阵列基因转录分析发现碘胺酮和丙戊酸是过氧化物酶体增殖物激活受体PPARα/(β/δ)/γ的激动剂。
1.4.2“三明治”模型
通过循环灌流法分离大鼠原代肝细胞，将其置于双层胶原之间培养，可建立“三明治”培养模型(sandwich-culturedrathepatocytes,SCRH)。传统的原代肝细胞培养方式无法维持肝细胞的极性和代谢功能，而SCRH可同时拥有肝细胞形态和胆管的网络状结构，维持外排转运蛋白的功能性表达，培养3个月均可检测到白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白和尿素的表达。胆汁淤积性肝损伤在中药源性肝损伤中占有较高的比率(＞30%)，各种胆汁酸是胆汁淤积性肝损伤的主要损伤因素，可直接破坏细胞脂质膜，甚至诱发细胞凋亡，同时介导中性粒细胞浸润，促进肝脏炎症反应。因此阐明胆汁淤积的相关机制是中药肝毒性研究的重要方向。SCRH已成为研究胆汁淤积和代谢酶诱导相互作用的主要工具之一。Zhuang等研究发现P-gp抑制剂利托那韦显著减少了大鼠SCRH模型中雷公藤甲素（TP）的胆汁清除率，同时P-gp诱导剂明显增加了TP的胆汁清除率，提示胆小管膜表面表达的P-gp和TP可能会发生相互作用。Shen等运用SCRH模型研究TP肝毒性的机制，结果显示CYP3A4诱导剂可以减轻TP的肝毒性，而抑制剂会加剧TP的肝毒性，推测CYP3A4介导的TP的代谢途径有可能是其解毒的机制。
1.4.3凝胶包埋肝细胞模型
凝胶包埋肝细胞模型是一种三维拟组织化的体外肝细胞培养方式，可模拟药物体内作用情况。单层贴壁培养的肝细胞很快丧失肝分化功能，不能较好地反映肝脏脂质代谢情况。凝胶包埋肝细胞模型可以较好的模拟体内细胞间微环境，保证代谢功能的长期维持，孟琴团队研究发现非诺贝特和平板培养肝细胞共孵育时，脂肪堆积和氧化压力均不明显，而凝胶培养肝细胞却表现出与体内相符的毒性反应，ROS和MDA等氧化应激标志物上升，过量脂质和脂肪堆积。因此，凝胶包埋培养细胞比单层培养细胞对药物的肝毒性更为敏感。该团队还在此模型上验证了利福平、四环素和硫唑嘌呤等20种药物的肝毒性-。
1.4.4微型中空纤维生物反应器
由具有活性和功能的肝细胞，以及可供细胞培养的生物反应器构成，将肝细胞置于生物反应器内，药物通过半透膜与肝细胞进行生化作用。沈冲等证实该模型比单层培养肝细胞对对乙酰氨基酚毒性更敏感，这可能是因为中空纤维凝胶反应器具有较高的肝药酶活性。此外，在中空纤维反应器中，甘草和甘草酸也体现了一定的保肝作用。
1.5肝损伤潜在血清生物标志物
新的肝损伤生物标志物，如精氨酸酶、血清F蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、苹果酸脱氢酶等虽然受到了广泛如何治疗皮肤白癜风中科白癜风医院善行天下
