华夏肝病论坛｜袁正宏教授：乙肝病毒cccDNA的存留、调控和清除研究原创华夏联盟瑞金感染瑞金感染科
复旦大学上海医学院医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室的袁正宏教授作了题为“乙肝病毒cccDNA的存留、调控和清除研究”的精彩报告。以下是文字记录。
乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染人数全球约2.5亿，长期位居我国甲乙类传染病发病数首位。目前核苷（酸）类似物和干扰素治疗尚不能达到乙肝临床治愈，在未行抗病毒治疗的人群中，慢性感染易进展为肝纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌，全球每年逾70万人群死于病毒性肝炎相关肝硬化，慢性HBV感染仍严重危害着人类健康。
目前丙型肝炎病毒（HCV）自年命名以来已被一众DAA药物攻克，达到临床治愈，由此年诺贝尔生理学或医学奖授予了哈维阿尔特、米歇尔霍顿和查尔斯瑞斯三位科学家以表彰其发现HCV。从丙肝治愈之路看乙肝治愈难点，后者难以治愈的核心病原学基础在于cccDNA，即共价闭合环状DNA，cccDNA既是HBV转录复制的模板，又是病毒基因储存库。不同于HCVRNA受复制酶抑制剂制约由此可高效根除HCV病毒，HBV的逆转录酶抑制剂虽可抑制其复制，但并不靶向cccDNA，而cccDNA难以根除是慢乙肝患者停药后复发的关键。目前缺乏HBV相关研究模型和技术，阻碍其机制和靶点研究。HBV侵入肝细胞后释放松弛环状DNA（rcDNA），在相关宿主因子的协助下修复形成3.2kb的cccDNA，随后在一众宿主因子（例如组蛋白、调节因子）和病毒因子（HBc、HBx蛋白）的作用下形成独立于宿主基因组的微染色体。当下cccDNA生物特性及调控清除机制的深入研究主要围绕①rcDNA→cccDNA形成，②微染色体装配，③cccDNA微染色体转录，④表观遗传调控，⑤功能性静默和⑥降解清除机制等方面展开，仍有很大一块未能阐明的缺口。
研究HBVcccDNA的技术壁垒在于①cccDNA数量低，检测困难（由于宿主特异性限制，仅HBV感染情况可产生cccDNA）；②非感染模型无法形成cccDNA，HBV复制模型无法模拟微染色体；③现有认知多来源于鸭乙肝病毒（DHBV）模型推论。HBV长期体外感染模型的开发仍在进行中，其有效建立利于病毒持续感染的机制研究，清除cccDNA的药物研发以及对病毒感染的固有免疫应答的研究。Xiang等成功建立了人原代肝细胞（PHH）体外长期培养的5C模型，支持HBV体外长期感染形成稳定的cccDNA，该模型发表于年的Science上。HBV机制研究的关键技术问题在于缺乏操作简便、适合高通量筛选的cccDNA研究模型，就此袁正宏团队建立了Cre介导的HBV重组cccDNA（rcccDNA）细胞系和小鼠模型，克服了HBV自然感染细胞内cccDNA含量低、难监测的难题，使模型小鼠肝内模拟的cccDNA分子持续时间长达30周，HBsAg和HBcAg持续时间长达52周。
目前检测病毒核酸或蛋白的方法都基于大量细胞的平均水平，例如用ELISA、WesternBlot、免疫组化的方法检测病毒蛋白，用PCR、Southern/NorthernBlot、二代测序的方法检测病毒核酸；而病毒在单细胞、单分子水平上的信息及其亚细胞定位的信息亟需新技术新方法来获得，由此，免疫荧光联合三维显微成像术，基于bDNA的原位杂交显色技术，以及基于CRISPR-Tag的cccDNA活细胞示踪系统等显影方法相继问世，或可成为研究HBV在患者肝内单细胞水平的“生活方式”及“时空特征”的利器。
借助可视化技术，近年来HBV基础研究结果显示：①单细胞水平病毒核酸信号数量差异明显，揭示病毒复制存在高度异质性，HBV子代病毒核酸复制的动力学缓慢；②cccDNA在细胞有丝分裂过程中丢失率高，剩余的cccDNA分子会随机分配到子代细胞；③HBV慢性感染肝内的HBVDNA、cccDNA信号与HBsAg信号互斥分布，HBV抗原与核酸在单细胞水平呈马赛克状分布；④抗病毒治疗后肝内HBVDNA和cccDNA持续维持，并由此提出HBV慢性感染持续存留的“三阶段”理论，即抗原富集期（antigen-richstage）、HBVDNA富集期（DNA-richstage）和cccDNA富集期（latentstage），刷新对HBV生活史和乙肝自然史的认知。
乙肝病毒学治愈至功能性治愈的跃迁要求患者满足①外周血中HBVDNA和HBsAg长期阴性且②肝内cccDNA含量极低或处于非活动状态两大条件，而HBVcccDNA活性调控和清除的机制研究对于厘清乙肝的功能性治愈至关重要。cccDNA清除的潜在途径包括如下方面：①杀细胞式清除（免疫耐受/损伤）：其中CD8+T细胞是HBV急性感染过程中对病毒清除和疾病进程控制的主要效应细胞；②非杀细胞式清除：IFN-γ和TNF-α可协同诱生APOBEC3A和APOBEC3B，且构建高表达IFN-γ和TNF-α的HBV特异TCR-T细胞可激活肝细胞中APOBEC3的表达，如何提升其效率将成为后续研究重点；③丢失稀释：cccDNA在肝细胞分裂时会丢失，但该周期较长，依赖于宿主细胞更新；④功能性静默：干扰素对cccDNA的活性具有抑制效应，且微染色体的表观遗传修饰呈抑制特征。
HBVcccDNA微染色体表观调控是近来研究慢性感染时HBVDNA由高转录至低转录再至休眠（隐性感染）状态的热点话题，学界对抑制性表观调控位点和介导因子的探索展露出了浓厚兴趣。袁正宏团队筛选发现宿主蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）可限制HBV转录复制，鉴定到HBV基因组表观抑制修饰的关键位点是cccDNA-H4R3me2s。因PRMT5较特异地抑制cccDNA活性，有望成为针对HBV“引擎”的“制动装置”。
此外，HBx亦可影响cccDNA的表观活性，促进cccDNA转录，在HBx基因缺失的小鼠rcccDNA模型中，表观活性受抑的cccDNA体内持续时间延长。HBx缺失和干扰素处理后间接导致的HBx转录和表达降低均降低了cccDNA微染色体的可及性从而显著抑制cccDNA表观活性，而表观活性受抑的cccDNA对抗病毒分子抵抗性更高。
目前彻底控制清除cccDNA仅靠一种策略难以实现，cccDNA的调控及降解和结构生物学等认识的空白有望在不远的未来得以解答，因此联合对cccDNA生化特征的认识、机体在急性感染时免疫系统清除cccDNA的方式以及操纵编辑DNA的新技术，有望实现这一目标。
瑞金感染科-彩虹记者团：
尚大宝、付豪爽、钱聪、张宸溪、张金铭、蔡明豪、冯明洋、王捷骁、姜绍文、李文静
文字：蔡明豪
编辑：曹莉，李自强
审核/审阅：谢青，项晓刚：，。视频小程序赞，轻点两下取消赞在看，轻点两下取消在看
原标题：《华夏肝病论坛｜袁正宏教授：乙肝病毒cccDNA的存留、调控和清除研究》
