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年11月17日，NatureCommunications在线发表了南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室徐强教授课题组题为“CUG-bindingprotein1regulatesHSCactivationandliverfibrogenesis”的文章，该文章在HSCs中发现了一个新的信号转导新环路并且利用汉恒生物的AAV将其精准定位于HSCs中，而CUGBP1则将TGF-β和IFN-γ两个信号通路联系在了一起，更重要的是筛到了一个小分子梣酮，为肝纤维化的治疗提供了新策略。我们便以该文为例，尝试着为大家分析一下临床发高分文章的套路，希望能够帮助大家好好利用手中的临床资源。
背景知识
肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)也称为Ito细胞、储脂细胞，或窦状隙周(围)细胞，胞浆富含VitA脂滴，HSC约占肝脏细胞总数的13%。HSC位于Diss间隙，具有长的分枝状的细胞突起，通过这些细胞突起包绕肝细胞并与肝窦内皮细胞形成紧密接触，为HSC和肝细胞的相互作用奠定了生理解剖学基础。HSC活化是肝纤维化形成，并最终发展至肝硬化的核心环节。“肝炎-肝纤维化/肝硬化-HCC”被认为是肝癌发生过程中的三部曲。HSC在“炎症-纤维化-肿瘤”这一发生发展过程中充当了重要的介质。近年来研究提示HSC活化在HCC的发生、发展和转移中可能扮演重要角色，通过增强分泌细胞因子、趋化因子、生长因子和ECM蛋白、降低ECM的降解而起作用。而且，在肝癌的间质中伴有活化HSC/MBF(肌成纤维细胞)的浸润，活化的HSC可能通过释放包含生存信号的旁分泌因子促进肝癌形成，机制尚不明。临床证据显示癌周HSC往往和肝癌的早期复发相关。目前为止，普遍认为HSC基本的非免疫学功能包括维生素A代谢平衡、肝纤维化和调节肝脏血流。更深入的研究发现了HSC的新的功能，HSC具有潜在的免疫学作用。近来研究提示HSC活化在HCC的发生、发展和转移中可能起了至关重要的作用。在活化的HSC中，TGF-β上调而IFN-γ被抑制，这说明在肝纤维化过程中HSC的活化和稳态之间存在着失调，IFN-γ可以通过诱导Smad7来抑制TGF-β，然而在HSC活化过程中，TGF-β是如何调控IFN-γ的却并不清楚，本文对此进行了探索。
一、CUGBP1的表达与肝纤维化程度相关。作者首先检测了正常和不同时期肝纤维化病人肝脏样本中CUGBP1的表达。发现CUGBP1的mRNA在肝纤维化病人中显著增加了（Fig.1a）。IHF(Immunohisofluorescence)结果则表明CUGBP1在α-SMA和cytoglobin双阳性的活化HSCs中高表达（Fig.1b）。
值得注意的是，CUGBP1的表达随着肝纤维化的进展而升高，且与其正相关（Fig.1c）。
另外，观察到BDL小鼠肝脏中的HSCs中CUGBP1选择性的高表达（Fig.1d,e）。体外实验也表明，在肝脏巨噬细胞、肝窦内皮细胞或者NK细胞中，TGF-β可以增加CUGBP1的表达，而LPS不可以，这与体内结果一致（Fig.S1）.
看到这里许多临床科研工作者是不是很熟悉？你手中是不是就握有大量的临床样本，而这些样本中总有一些是某些仍未被报道的高/低表达？确认了CUGBP1在肝纤维化不同进展期表达不同并且傍上了TGF-β这个大款之后应该怎么办呢？当然是搞清楚CUGBP1与TGF-β的确切关系了！光靠暧昧搞大新闻是木有用滴！
二、在HSCs中，TGF-β通过p38MAPK上调CUGBP1的表达
在LX-2细胞和小鼠初级HSCs中，TGF-β均可以明显诱导CUGBP1的表达，而在L02细胞和小鼠初级肝细胞中则不可以（Fig.2a-c）。
之后作者观察到，TGF-β并没有抑制CUGBP1mRNA的降解（Fig.2d）。
使用不同的TGF-β信号通路抑制剂处理已用TGF-β预处理过的LX-2细胞发现，TGF-β受体I抑制剂SB和p38MAPK抑制剂SB可以阻滞CUGBP1表达的增加，而JNK抑制剂SP、ERK抑制剂FR或Smad3抑制剂SIS3则不可以（Fig.2e）。之前的报道表明，TGF-β可以通过p38MAPK激活ATF2。而作者的结果也表明，在LX-2细胞中TGF-β可以通过p38MAPK诱导ATF2的磷酸化（Fig.2f）。
通过gene2promoter工具搜索分析，在人CUGBP1的promoter区域发现了一个类似CRE（cAMPresponseelement）区域（Fig.2g）。并且实验表明，在LX-2细胞中使用TGF-β刺激，pT-ATF2可以与CUGBP1promoter内的该CRE样区域结合（Fig.2h）。因此我们可以假设，在LX-2细胞中，TGF-β通过p38MAPK/ATF-2通路诱导CUGBP1mRNA的表达。
在背景知识介绍里我们也讲了，之前就有研究表明在活化的HSC中，TGF-β上调而IFN-γ下调。又是一个牛逼哄哄的通路，不拉它下水实在可惜。于是作者又探索了CUGBP1和IFN-γ与HSC活化的关系。三、CUGBP1通过减少IFN-γ的表达来促进HSC的活化
接下来作者推测升高的CUGBP1表达可能与HSC的活化相关。因此作者在LX-2细胞中转入了siRNA来敲低CUGBP1的表达。qPCR结果表明siRNA可以有效敲低CUGBP1的mRNA水平（Fig.3a）。敲低CUGBP1可以有效减少α-SMA的mRNA和蛋白水平（Fig.3b,c），并且可以增加IFN-γ（Fig.3b,d,e）。之前报道表明IFN-γ通过诱导Smad7的表达来抑制HSC的活化。作者的实验表明，在LX-2细胞中敲低CUGBP1可以增加IFN-γ的表达、STAT1的磷酸化以及Smad7的表达（Fig.4a,b）。接下来，作者通过两种方法来抑制IFN-γ信号：通过使用IFN-γ的抗体中和IFN-γ或使用STAT1不表达的U3A细胞来阻滞STAT1的激活。中和IFN-γ几乎可以完全消除由于敲低CUGBP1引起的α-SMA的减少（Fig.4c）。而在STAT1不表达的U3A细胞中敲低CUGBP1并不能抑制α-SMA的表达（Fig.4d）。而在2fTGH细胞中，Smad7也有明显的升高（Fig.4d）。以上结果表明，由CUGBP1敲低引起的IFN-γ升高最终导致了α-SMA的降低。
那么问题来了~CUGBP1是如何减少IFN-γ的表达的呢？
四、CUGBP1通过结合到GRE上诱导IFN-γmRNA的降解在Hela细胞中，CUGBP1通过结合到转录本的3’-UTR区域的GRE上促进mRNA的降解。因此作者通过电脑搜索了IFN-γ的mRNA序列，结果在其3’-UTR区域找到了一个9核苷酸的保守序列，5’-UGUGUGUUU-3’(Fig.5a)。然后，作者通过mRNA-protein沉淀实验发现，IFN-γGRE-Biotin结合并且沉淀出CUGBP1，而GRE突变后则不可以（Fig.5b）。通过IFN-γGRE探针竞争性结合实验发现只有没有突变的GRE探针可以竞争性结合到CUGBP1上（Fig.5c），以上实验表明，CUGBP1可以特异的结合到IFN-γGRE上。而进一步的浓度梯度实验确定了CUGBP1与IFN-γGRE结合的最佳浓度为5.7nM（Fig.5d,e）。这种结合导致的IFN-γmRNA的降解是一种时间依赖的方式，并且敲低CUGBP1可以完全抑制这种mRNA的降解（Fig.5f）。
好了，TGF-β和IFN-γ这两个大咖已经被绑上我们的战车，那么下一步就该搞清楚CUGBP1与肝纤维化的关系了。有时候Knockdown比Overexpression更能说明问题，所以……
五、减少CUGBP1的表达可以减轻小鼠肝纤维化
在这里作者并没有单纯用shRNA来KnockdownCUGBP1的表达，而是筛了一个小分子抑制剂，因为作者期望CUGBP1作为临床治疗的一个靶标！这可是一个大大的加分项啊！作者从自然产物中筛选CUGBP1的小分子抑制剂，从而进一步确认CUGBP1在HSC活化中的作用，并且期望能够将其用于肝纤维化的治疗中。作者从白鲜皮（CortexDictamni）中纯化出了一个小分子抑制剂fraxinellone，在TGF-β激活的LX-2细胞中它可以减少CUGBP1、α-SMA和I型前胶原蛋白的mRNA和蛋白水平，这些蛋白都与HSC的活化抑制相关。Fraxinellone对于HSC活化的特定作用与小鼠中BDL诱导的肝纤维化改善相关。Fig.6a表明，在BDL诱导的小鼠肝脏切片中观察到了肝细胞中的脂肪变性、中央静脉壁的轻度增厚、纤维组织增生、炎症细胞浸润和胶原沉积。而使用Fraxinellone处理可以有效改善这些生理指标，并且具有剂量依赖效应（Fig.6a,b）。发生纤维化的小鼠中血清透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原蛋白和肝脏羟脯氨酸的表达都有增加，使用20或者40mg/kg的fraxinellone处理会显著中和这些生化指标的变化。另外fraxinellone以一种剂量依赖的方式抑制肝脏中III型胶原α1、IV型胶原α1和α-SMA的mRNA表达（Fig.6e）。BDL诱导的肝脏纤维化发生过程中，20或者40mg/kg的fraxinellone也可以减少CUGBP1和α-SMA的蛋白表达（Fig.7a,b），而IFN-γ的表达水平则增加了（Fig.7c）。同时，作者发现在fraxinellone处理的BDL小鼠中，pY-STAT1的表达增加了而pSmad2的表达则减少了（Fig.7a）.之后作者在肝脏细胞中用AAV-shRNA-CUGBP1敲低CUGBP1的表达，而在HSCs中则用vitaminA偶联的脂质体载体转入siRNA-CUGBP1来敲低CUGBP1的表达，使用AAV-pGFAP-CUGBP1在HSCs中过表达CUGBP1。作者发现AAV-shRNA-CUGBP1和VA-Lip-siRNA-CUGBP1可以缓解肝纤维化，而AAV-pGFAP-CUGBP1则加剧了肝纤维化（Fig.8）。
另外，在HSCs中过表达CUGBP1几乎完全消除了fraxinellone对于肝纤维化的改善作用（Fig.8a-c）。而通过VA-Lip-siRNA-CUGBP1敲低CUGBP1可以改善小鼠的肝纤维化而且fraxinellone无法继续提升这种改善（Fig.8d-f）.
因此，作者推测在HSCs中fraxinellone导致的CUGBP1的降低与肝纤维化的改善相关。与此一致的是，在BDL小鼠的肝脏中，AAV-shRNA-CUGBP1和VA-Lip-siRNA-CUGBP1减少α-SMA的表达，AAV-pGFAP-CUGBP1增加α-SMA的表达（Fig.9a）。而且，当使用AAV-shRNA-CUGBP1感染BDL小鼠中的HSCs时，IFN-γ的表达也明显增加了（Fig.9b）。以上实验结果表明，HSCs中CUGBP1的增加对于肝纤维化的发展有重要作用。
ABOUTAAV
腺相关病毒
在这里我们不得不插播一则小广告~哦，不！是一个小知识点O(∩_∩)O~
AAV是什么鬼？小编看到这里的时候是一脸茫然！难道是2A级的AV~额(⊙o⊙)…，太污了！查了一下，原来是Adeno-associatedvirus腺相关病毒啊！小编之前无论是KD还是Overexpression都是用Lenti-Virus慢病毒，腺相关病毒是啥，赶紧Google了一下“慢病毒腺相关病毒”，结果……
你妹啊！Google也沦落为百度第二了么？怎么出来的前几名都是这个公司的资料~点进去看看吧！发现Google诚不欺我，果然满满的干货，在其技术资料部分不仅仅有慢病毒腺相关病毒的资料介绍，还有以下内容：
这真是一个有情怀的公司哈~居然这么多干货，感兴趣的可以去看看上面的资料，还是不错的。而且非常巧合的是，该篇NC文章也是用的该公司的AAV病毒……
AAV现在也是非常前卫的，由于其性质甚至已经有人在致力于使用AAV进行基因治疗的临床研究，所以大家也要多去了解这些先进的技术。
那么说了这么多，AAV相比慢病毒到底有哪些优点呢？
1.安全性好，迄今从未发现野生型AAV对人体致病（80%的人感染过AAV）；重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；2.宿主范围广，不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；3.有比较强的靶向性，可以选择特定的器官进行转染4.AAV-2的基因组仅个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作；5.物理性质稳定。在60℃不能被灭活，能抗氯仿；6.重组AAV(rAAV)可长期稳定地表达外源基因。
这项研究的主要创新点在于，发现了肝星状细胞中存在TGF-β-CUGBP1/IFN-γ-Smad7/TGF-β-α-SMA信号转导新环路，而CUGBP1及其与IFN-γmRNA相互作用是联系HSC中TGF-β和IFN-γ这两条功能相反的信号通路、构成上述新环路的关键节点，并借助小分子化合物fraxinellone（梣酮），实现了从新的切入点调控肝星状细胞活化和稳态，为肝纤维化的治疗提供了新策略。最后作者将该文总结如下图：
好了，让我们最后总结一下该篇文章的套路，以期来指导我们的研究！小编能想到的就只有这些了，如果您有什么好的意见或者建议欢迎按文末方式入群交流！北京哪家医院看白癜风专业北京哪有专治白癜风的医院
