DehnadA,FanW,JiangJX,etal.AGER1downregulationassociateswithfibrosisinnonalcoholicsteatohepatitisandtype2diabetes[publishedonlineaheadofprint,Jul13].JClinInvest.;.
研究背景非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis,NASH）正迅速成为全球最常见的慢性肝病。胰岛素抵抗或2型糖尿病（type2diabetesMellitus,T2DM）患者有发展为并发坏死性炎症和纤维化的晚期非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis,NASH）的风险。糖尿病患者高血糖易导致晚期糖基化终产物（Advancedglycationend-products,AGEs）的形成和积累，引起炎症反应并导致T2DM患者的血管、肾脏或视网膜并发症。已确认AGEs在导致NASH坏死性炎症和纤维化过程中起重要作用，然而AGE介导损伤的机制或涉及的肝细胞类型尚不清楚。
另一方面，AGEs从循环中清除并由AGEs受体1(AGEreceptor1,AGER1)解毒。AGER1在NASH中的作用尚未被研究。糖尿病患者在高AGEs状态下AGER1的表达下调或功能受损可能会导致AGEs的进一步积聚，从而导致AGEs受体(receptorforAGEs,RAGE)参与之后的促炎反应。RAGE与通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶(NOXs)激活产生的氧自由基有关。目前尚不清楚哪种NOX亚型参与了肝脏AGEs/RAGE介导的ROS的生成。
研究结果1、高AGEs饮食肝细胞RAGE在调节炎症和纤维化中的作用RAGE由肝细胞表达，但其功能尚未明确。因为目前用于动物研究的CHOW饲料中AGE含量并不高，为了聚焦于AGEs和RAGE，作者应用了高AGEs饲料。作者在高温下制备了高AGEs饲料(HiAD)，并饲养小鼠14周。HiAD小鼠血清和肝脏AGEs高于通常用于研究NASH的快餐饮食（fastfooddiet,FFD)小鼠（Figure1A、SupplementalFigure1,饲料组份在SupplementalTable1）。吡哆胺（pyridoxamine,PM）是一种维生素B6衍生物，可通过捕获碳基化合物和抑制Amadori产物的形成来减少AGEs。作者用PM处理HiAD饮食的fl/flRAGE小鼠（下文简称为WT小鼠）。作者还建立了肝细胞RAGE基因敲除（RageHepKO）小鼠并分别给予正常或HiAD饮食。这些小鼠正常饲料饲养时表现为正常表型。作者发现接受PM处理的HiAD饲养WT小鼠和HiAD饲养RageHepKO小鼠的肝脏和血清AGEs降低（Figure1B）。在HiAD饲养WT小鼠中，作者观察到严重的NASH并伴有坏死性炎症、肝细胞气球样变、脂肪变性（NAFLD活动评分[NAS]5-7分）、纤维化（天狼红[PSR]）和脂质过氧化（4HNE）（Figure1C）。体重和肝脏/体重比在处理组中没有明显变化（尽管HiAD组由于最初食物摄取量少而有体重下降趋势，SupplementalFigure2）。HiAD饲养RageHepKO小鼠和经PM处理的HiAD饲养WT小鼠的ALT水平、NAS评分（HiAD+PM组为1-2分；RageHepKO组为0-1分）、炎症转录产物的表达（Mcp1,TNFα,IL1b）（Figure1D）、羟脯氨酸含量和纤维化转录产物的表达（Col1a1,Tgfb1,Mmp2）明显减弱（Figure1E）。作者发现HiAD饲养WT小鼠的碱性磷酸酶有增加趋势，在PM处理后有所下降，各组小鼠碱性磷酸酶和总胆红素水平没有明显变化（SupplementalFigure3）。根据葡萄糖/胰岛素耐量实验（GTT/ITT），HiAD饲养WT小鼠的胰岛素敏感性受损，但在HiAD饲养RageHepKO小鼠受损较轻(SupplementalFigure4)。
此前几项研究已经明确了NASH中反应性导管细胞（reactiveductularcells,RDCs）和纤维化之间的联系。作者观察到HiAD饲养小鼠中CK19+和SOX9+RDCs扩增，而FFD饲养（AGE含量较低）小鼠中扩增程度明显减低（SupplementalFigure5）。作者在HiAD饲养的PM处理WT小鼠和RageHepKO小鼠中检测到RDCs数量明显减少(Figure1F)。
2、AGEs通过RAGE诱导肝细胞产生NOX4和ROS4HNE在HiAD饲养WT小鼠的肝细胞中表达增强，而PM处理或RageHepKO小鼠明显较轻（Figure1C）。NOX4是肝细胞中一种转录激活的非吞噬细胞NOX同源物，是NASH中氧化还原自由基的主要来源，与内质网应激、肝细胞死亡和纤维化密切相关。作者发现HiAD饲养的PM处理WT小鼠和RageHepKO小鼠的ROS（Figure2A）和NOX4、NOX2（吞噬细胞NOX）（Figure2B）表达均减少，而HiAD饲养WT小鼠明显诱导表达。那么AGEs和RAGE是否将NOX4作为下游效应器？为了解决这一问题，作者在动物模型中进行了ChIP分析来研究NOX4启动子的活化情况。富含SMAD3的DNA实时定量PCR（RT-qPCR）分析显示HiAD饲养的WT小鼠肝脏样本中NOX4明显高于HiAD饲养的RageHepKO小鼠（Figure2C）。为探究NOX4在原代肝细胞中的诱导机制，用TGF-β中和抗体或者转染显性抑制TGF-βR2（dn-TGF-βR2）/空载体处理AGE暴露细胞，然后评估SMAD3磷酸化（p-SMAD3）（Figure2D）。AGEs诱导SMAD3磷酸化，并被TGF-β抗体或dn-TGF-βR2降低。RAGE基因敲除（RAGE-KO）肝细胞在AGEs的作用下SMAD3未被磷酸化。在上述条件下的原代肝细胞NOX4启动子被诱导，而AGE介导的TGF-β确实发挥了重要但不是独有的作用（Figure2E）。正如在体内观察到的那样，RAGE-KO肝细胞在AGEs作用后没有观察到产生ROX(Figure2F)。作者进一步评估了由AGEs/RAGE激活并可能参与SMAD3/NOX4轴的信号串扰。P38MAPK和JNK1/-2的磷酸化依赖于RAGE，并且抑制它们可降低SMAD3的磷酸化（SupplementalFigure6）。
为了研究在AGEs处理后产生ROS的NOX同系物，作者从WT、NOX4-KO和NOX2-KO肝脏（SupplementalFigure7A）分离出原代肝细胞、肝星状细胞（hepaticstellatecells,HSCs）和巨噬细胞，并用AGEs处理。在肝细胞中，NOX4是主要的NOX，而在HSCs中，NOX4和NOX2以及巨噬细胞中主要的NOX2，在AGE介导的ROS产生过程中起作用。然而，在HSCs中AGEs并不直接诱导转分化（SupplementalFigure7B）。为在体内进行验证，作者用常规或HiAD饲养WT小鼠14周，并在第7周注射6-Cre型腺相关病毒（AAV6-Cre）或对照试剂（AAV6-GFP）。AAV6靶向HSCs。与正常饲养小鼠相比，HiAD饲养小鼠的αSMA、Col1a1或血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase,ALT）水平没有显著变化（SupplementalFigure7C）。WT巨噬细胞在AGEs处理后显示出轻微的促炎活性，在NOX4-和NOX2-KO细胞中TNFα、IL10和IL1b的产生减少（SupplementalFigure7D）。为了研究AGE刺激肝细胞的潜在旁分泌作用，作者分离WT和NOX4-KO小鼠细胞并用μg/mLAGEs处理，再通过是否应用10mM谷胱甘肽（glutathione,GSH）处理将细胞分组。24小时后，更换培养基并用Transwell共培养系统将WTHSCs或巨噬细胞与肝细胞共培养（SupplementalFigure8）。作者发现AGE处理肝细胞明显诱导WTHSCs产生αSMA和Col1a1。使用GSH或NOX4缺失肝细胞共培养明显降低HSC活性。巨噬细胞与AGE处理WT细胞共培养可显著诱导IL1b、TNFα和IL6表达，而与NOX4-KO和肝细胞共培养没有这样的作用。GSH处理减弱了促炎转录本的表达（SupplementalFigure8）。
3、肝细胞AGER1的下调与NRF2活性降低有关作者研究发现AGER1在HiAD饲养小鼠（Figure3A）以及NASH和T2DM患者中明显下调。在小鼠中，PM处理增强了AGER1的表达，在HiAD饲养RageHepKO小鼠中显著增加。为了研究下调机制，作者用ALGGEN-PROMO分析AGER1启动子区域，发现了几个NRF2结合位点（Figure3B）。NRF2核转位调节靶基因下游的抗氧化反应元件（antioxidantresponseelements,AREs），从而减轻氧化应激。在HiAD饲养WT小鼠中NRF2靶向Hmox1和Dstp1显著减少，PM处理之后或HiAD饲养RageHepKO小鼠中可以得到改善（Figure3B）。此外，HiAD饲养小鼠中核NRF2信号减弱（SupplementalFigure9）。为了研究NRF2失调在AGEs反应中的潜在作用，肝细胞中的NRF2稳定性分析显示AGEs早期具有诱导作用，而随着暴露时间的延长，这种诱导作用消失，这表明AGEs促进NRF2降解(Figure3C)。BSA处理组和AGE处理组之间NRF2mRNA的表达没有显著差异(Figure3D)。
4、Cullin3复合体的类泛素化修饰导致NRF2失调NRF2的稳定性在多个水平上由复杂的机制调节。在本文中，实验证据表明翻译后修饰是对AGEs的反应。Cullin3(CUL3)作为支架蛋白与RBX1和KEAP1接头蛋白结合，而这两个接头蛋白又与NRF2结合。在氧化应激条件下，CUL3-KEAP1-E3连接酶泛素化NRF2的能力被抑制，从而使NRF2易位到细胞核。然而，一旦CUL3翻译后修饰（如类泛素化修饰），上述作用就不会发生，从而导致NRF2活性降低。作者发现，体内NEDD8激活酶(Nae1)的表达在HiAD饲养的WT小鼠中增加，而HiAD饲养的RageHepKO小鼠显著降低，PM处理和RageHepKO小鼠均诱导表达脱氧核苷酸Den1(Figure4A)。在HiAD饲养的WT小鼠中，CUL3类泛素化修饰明显，而在RageHepKO小鼠中不明显(Figure4B)。在体外，AGEs诱导HepG2细胞中CUL3的类泛素化修饰(Figure4C)。为了探讨NOX4是否参与NAE1的激活，作者用Ad-NOX4转导原代肝细胞，并检测Nae1的表达。作者发现Ad-NOX4或AGEs诱导该酶，并且当Ad-NOX4和AGEs联合处理时诱导作用更加显著(Figure4D)。作者在AGEs和NAE1抑制剂MLN存在的情况下，评估类泛素化对Ager1和NRF2靶酶的影响。抑制类泛素化导致Ager1、Gstp1、Hmox1和Nqo1的表达显著增加(Figure4E)。
5、通过AAV8介导的方法纠正NRF2可以改善AGER1、肝脏/血清AGEs、炎症和纤维化为了确定较低的NRF2活性是否与AGER1反应不足有关，作者在HiAD饲养的第7周给小鼠注射AAV8-GFP(对照)或AAV8-NRF2。AAV8-NRF2在体内逆转Ager1的下调，且肝脏和血清AGEs减少(Figure5A)。这些小鼠的Ager1以及NRF2靶基因Gstp1和Hmox1的水平升高(Figure5B)。炎症(Mcp1、TNFα、IL1b)(Figure5C)和纤维化(Col1a1和TGFβ)(Figure5D)转录本的表达水平也降低。同样地，AGEs显著下调原代WT肝细胞Ager1的表达，而腺病毒NRF2转导或降低GSH处理可增加AGE处理原代细胞Ager1的表达。与Ad-CMV转导细胞相比，GSH处理或NRF2转导后NRF2靶基因Gstp1和Hmox1的表达也显著增加(SupplementalFigure10)。
6、NASH和T2DM患者诱导表达RAGE，而清除性受体AGER1显著下调为了评估RAGE和AGER1在患者中的表达情况，作者用RT-qPCR分析了健康个体、脂肪变性患者和NASH合并胰岛素抵抗(NASH+IR)或T2DM(NASH+DM)患者的肝活检样本(Figure6A、B)。结果发现，NASH+IR和NASH+DM患者明显诱导RAGE表达，清除性受体AGER1明显减少(P0.05)，而脂肪变性患者中未见明显改变。免疫组化显示NASH+DM组肝细胞和巨噬细胞有较强的RAGE信号(Figure6C)。糖化血红蛋白(HbA1c)是研究最多、临床应用最广泛的AGEs，它是由血红蛋白的缬氨酸和赖氨酸氨基与葡萄糖发生非酶反应产生的。对一组接受减肥手术患者的肝脏活检分析显示，组织层面NASH和HbA1c异常(5.7)的患者有更高的导管反应(ductularreaction,DR)和气泡样变性(Table1)。此外，作者发现DR与肝脏AGER1的表达水平较低有关(Figure6D)。
研究结论1、高AGEs下调AGER1并诱导表达促炎受体RAGE，并通过RAGE诱导肝细胞产生NOX4和ROS在调节炎症和纤维化中起关键作用；
2、类泛素化修饰Cullin3导致的NRF2活性降低与AGER1的下调有关；
3、肝脏中AGEs的长期暴露促进AGER1/RAGE失衡，从而促进炎症和纤维化；
4、通过AAV8介导的方法纠正NRF2可以改善AGER1，降低肝脏/血清AGEs、炎症和纤维化，这对于预防2型糖尿病患者进展为NASH和肝纤维化是一种潜在的治疗策略。
校对：张涤非
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