背景：
转录组分析可以研究人类组织的基因表达，它是一个有价值的工具，以表征肝功能，在肝病期间的基因表达变化，确定预后标记或特征，并促进发现新的治疗靶点。与全组织RNA测序分析相比，单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组可以在单细胞或空间水平上研究转录活性。ScRNA-seq为发现正常和病变肝脏中先前未知的细胞类型和亚型、研究肝祖细胞等罕见细胞以及非实质细胞在慢性肝病和癌症中的功能作用提供了很好的研究手段。
简介：
年6月10日，来自法国InstitutdeRecherchesurlesMaladiesViralesetHépatiques,UniversitédeStrasbourg的ThomasF.Baumert教授和英国爱丁堡大学TheQueensMedicalResearchInstituteNeilC.Henderson教授课题组在JournalofHepatology（IF:18.）杂志上发表题为“Single-cellgenomicsandspatialtranscriptomics:discoveryofnovelcellstatesandcellularinteractionsinliverphysiologyanddiseasebiology”的综述[1]。通过在单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据中添加空间信息，空间转录组学改变了对组织功能组织和细胞间相互作用的理解。这些方法最近被应用于研究肝脏再生、肝细胞和非实质细胞的组织和分工，以及描绘慢性肝病和癌症的单细胞图谱。在本文中，作者回顾了scRNA-seq和空间转录组方法背后的原理和技术，强调了这些方法在肝脏生理学和疾病生物学方面的最新发现和新见解。
主要结果：
单细胞水平的肝脏生理学。
scRNA-seq的首批应用之一是研究小鼠和人类的肝脏分带。肝脏是一个高度组织化的组织，肝腺泡的肝-中轴是体内平衡和疾病发展的基本功能单位。肝细胞的功能沿着这个轴变化，肝细胞通常分为三个区。在肝脏生理学研究中使用scRNA-seq的一个主要挑战是单个细胞RNA数据与空间信息的整合。
图1：研究肝脏病理生理学的单细胞RNA测序分析。
A)将正常和/或患病的肝脏组织分离成单个细胞悬液，进行scRNA-seq。每个细胞被压缩在一个二维空间中，每个细胞是一个点，细胞之间的距离是它们相似度的函数。可以将细胞聚合为簇或簇的组，以不同的颜色绘制，并可能表示细胞类型或子类型。通过配体-受体分析，可以研究罕见细胞类型、细胞状态和亚型异质性、疾病特异性细胞类型和细胞间相互作用。B)计算分析，如伪时间扩散映射或RNA速率，分析细胞相似性和多样性，跟踪分化过程，克隆进化和特定细胞类型或不同细胞类型之间的细胞状态转变。
图2：来自于scRNA-seq研究的肝脏分区的新概念。
A)带形基因在肝小叶的中间层呈非单调分布。B)门周(左)和中心周围（右）基因上小鼠肝细胞分带的决定因素。C-D)肝窦内皮细胞(LSEC)特异性分区通路。门周LSECs富集于激素信号和代谢途径，而中心周围LSECs富集于免疫调节基因、Wnt相关基因、血小板激活和清除功能途径。LSECs和肝细胞在Wnt相关基因(小鼠数据)和血小板激活和清除功能通路(人类数据)的中心周围区域显示共分区。
从标准的scRNA-seq数据推断空间信息的挑战之一是需要通过直接的空间技术(如免疫组织化学、免疫荧光或FISH)进行仔细的后续验证。为了克服这个问题，允许原位空间转录组的系统最近被开发出来。
图3：原位空间转录组模型。
利用SCRNA-SEQ鉴定肝脏发育和再生过程中的祖细胞。
通过对人胎肝的单细胞分析，研究人员发现了一种独特的肝胆杂交祖细胞(HHyP)，它能够向肝细胞或胆道上皮细胞分化。胎儿HHyP属于EPCAM+/NCAM+/TROP2-成分，同时显示胆管细胞、肝细胞和经典祖细胞标志物。肝导管板是肝细胞与门脉间质交界的单层或双层小立方细胞结构。
在正常肝脏中，祖细胞通常是静止的，它们在肝损伤后的作用和激活机制尚不清楚。在动物模型中，可以通过几种策略模拟不同的肝脏病理，以可重复的方式诱导肝损伤。ScRNA-seq已成功应用于小鼠肝损伤模型，研究肝再生驱动因子，发现YAP靶基因是EPCAM+间室异质性的主要来源。
图4：scRNAseq显示正常人肝脏中存在双功能祖细胞。
人肝脏的ScRNA-seq鉴定出一种EPCAM+TROP2interCK19low祖细胞，具有分化为胆管细胞或肝细胞的潜能(人的数据)。在肝损伤时，祖细胞上调WNT-和YAP-靶基因，促进肝再生(小鼠数据)。
对慢性肝病和癌症微环境的新见解。
由肝细胞和非实质细胞(NPCs)组成的肝脏微环境在所有慢性肝病的发病过程中起着关键作用。在对慢性肝细胞损伤的反应中，免疫细胞产生促炎细胞因子和趋化因子，并将静止的肝星状细胞(HSCs)激活为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞负责胶原和细胞外基质的积累—肝纤维化的标志。scRNA-seq揭示了人类肝硬化纤维化微环境中巨噬细胞、内皮细胞和间充质细胞等与scar相关的新亚群，并阐明了这些不同类型的细胞如何相互作用促进纤维化。肝硬化纤维形成是一个高度复杂的过程，其特点是多种不同细胞系相互作用，处于不同的分化和激活状态。
图5：人肝纤维化微环境中细胞间配体和受体的相互作用。
本文介绍了参与scar相关巨噬细胞、scar相关间充质细胞和scar相关肝内皮细胞相互作用的主要受体和配体。与之相关的分子主要有Notch信号、PDGF和VEGF、TGF因子和TNF家族。
scRNA-seq帮助描述了HCC微环境中各种细胞类型的细胞表型，并阐明了癌症上皮细胞和TME之间的相互作用。HCC是一个复杂的细胞生态系统，包括克隆Tregs、克隆CD8+LAYN+Tex、未耗竭的CD8+GZMK+细胞、LAMP3+DC、髓源性抑制细胞、TAM样巨噬细胞和类似于居住在肝纤维化生态位的内皮细胞的PLVAP+内皮细胞。ScRNA-seq和空间转录组方法将是有价值的工具，有助于我们加深对调控TME的细胞和分子机制的理解，这反过来将有助于识别新的肝癌治疗靶点。此外，这些方法还有助于发展更精确的肿瘤分类和患者分层，从而完善该领域的临床试验设计。
图6：应用scRNASeq观察肝癌的肿瘤微环境。
肝细胞癌(HCC)在克隆的CD4+CTLA4+Treg和表达相同的TCR(T细胞受体)的耗竭的CD8+LAYN+淋巴细胞富集。CD8+LAYN+淋巴细胞来源于CD8+GMZK+淋巴细胞。LAMP3+树突状细胞(DC)是HCC中富集的成熟DC，通过IL-15和PD1/PD-L1轴与耗竭的T细胞和Tregs相互作用，能够迁移到淋巴结。HCC微环境也包括具有强免疫抑制功能的髓系来源的抑制细胞，以及肿瘤相关巨噬细胞样细胞，具有中度炎性免疫抑制表型并表达TREM2。
结论和展望：
ScRNA-seq是一项革命性的技术，已成功应用于健康和患病肝脏的生物学研究，捕获细胞类型和状态的异质性，并表征细胞间的相互作用。选择scRNA-seq方法取决于研究设计、终点和成本，通常需要在成本和基因覆盖率之间做出协调。计算算法、直接空间转录组学、scRNA-seq和空间技术的结合使研究复杂、高度空间组织中的单细胞基因表达成为可能。
在理解肝脏分区、再生以及慢性肝病和癌症的生物学方面，ScRNA-seq已经带来了革命性的新发现。肝病生物学涉及多种细胞类型和复杂的细胞间相互作用，而scRNA-seq允许对这些多细胞微环境进行详细的研究。目前的挑战是充分利用并将这些新知识转化为有效的新治疗方法，以应对肝病学临床上的主要挑战。
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