研究背景：
肝纤维化与肝脏炎症同时发生，肝脏炎症已被强调为治疗慢性肝病的有效方法。先前我们证明川芎的有效成分四甲基吡嗪（TMP）可以抑制HSC的活化，从而抑制肝纤维化。在这项研究中，我们的研究表明TMP改善了肝脏的组织学结构，降低了肝酶水平，并减弱了大鼠纤维化肝脏中的胶原蛋白沉积。此外，TMP通过抑制炎症并降低炎症细胞因子（包括肿瘤坏死因子-a（TNF-a），NLRP3，核因子-κB（NF-jB））的水平，从而显着保护肝脏免受CCl4引起的损伤和纤维形成。）和白介素1b（IL-1b）。体外实验表明，TMP抑制了与破坏血小板源性生长因子-b受体（PDGF-bR）/NLRP3/caspase1途径有关的HSC中炎性细胞因子的表达。这些数据表明，TMP可能通过PDGF-bR/NLRP3/caspase1途径靶向造血干细胞，从而减轻肝纤维化中的肝脏炎症反应。它为TMP作为一种潜在的治疗肝纤维化提供了新的机制上的见解。
Result1：在大鼠模型中，TMP保护肝脏免受ccl4诱导的损伤，并抑制肝纤维化
图1A总检查表明,在用ccl4注入大鼠肝与正常肝相比观察病理形态学变化，造模后有明显肝损伤，但TMP治疗可以改善肝脏的病理变化,秋水仙碱作为阳性对照也有效明显减少肝损伤，TMP治疗和秋水仙碱也显著降低了肝/体重比，注射CCl4显著提高了肝/体重比。图1B显示，HE染色表明，TMP治疗可显着改善肝脏组织学，其表现为肝脏脂肪变性，坏死和肝纤维化间隔的改善。为了评估TMP对CCl4引起的肝纤维化的影响，对肝脏切片进行了Masson和picro-Sirius红染色以检测胶原蛋白的沉积，结果表明胶原蛋白在CCl4损伤的肝脏中严重沉积，并伴有结节形成，但在经TMP处理的大鼠肝脏中，TMP剂量依赖性地降低了这种药物的含量。图1C表明，羟脯氨酸是一种几乎只存在于胶原蛋白中的氨基酸。对肝和血羟脯氨酸的测定进一步表明，TMP可降低肝纤维化大鼠的胶原生成。图1D表明，TMP可以降低CCl4处理的大鼠的血清碱性磷酸酶，ALT和AST的剂量水平。图1E表明，TMP在蛋白水平上下调了a-sma、a(1)前胶原和纤连蛋白这三种肝纤维化的关键标志物。血小板源生长因子b受体(PDGF-bR)和转化生长因子b受体1(TGF-bRI)是两个关键受体发射pro-fibrogenic路径方法(16、17),这是合理的检查这两个受体的影响阐明TMP的潜在机制的抑制肝纤维发生在老鼠模型中。免疫荧光分析显示TMP可下调TGF-bRI和PDGF-bR(图1F)。这些结果证实了TMP可以抑制大鼠肝纤维化的发生。图1F免疫荧光测定显示TMP下调了TGF-bRI和PDGF-bR，所有这些结果证实了TMP在大鼠模型中抑制了肝纤维化。
Result2：TMP抑制CCl4大鼠模型的炎症反应
图2A免疫荧光测定所示，TMP降低了促炎信号分子TNF-a，NLRP3，NF-jB和IL-1b的表达。图2BElisa分析还证明，TMP剂量依赖性地降低了肝脏和血清TNF-a，IL-1b，IL-18，IL-6和IL-8的水平（图2B）。图2C表明，TMP在蛋白质水平上消除了纤维化肝中TNF-a，NF-jB，NLRP3，IL-1b的高表达。这些结果表明，TMP抑制了由CCl4引起的炎症，这可能导致保护肝脏免受伤害。
Result3：TMP抑制PDGF处理的造血干细胞中促炎性细胞因子的表达
图3A表明，PDGF实验中，我们观察到PDGF上调了炎症细胞因子（proIL-1b，pro-IL-18和裂解的IL-1b)mRNA水平的表达,且呈剂量依赖性。图3B表明，PDGF上调了炎症细胞因子（proIL-1b，pro-IL-18和裂解的IL-1b)蛋白水平的表达,且呈剂量依赖性。图3C中用ELISA检测上清液中IL-1b和IL-18的水平，发现PDGF上调了炎症细胞因子（proIL-1b，pro-IL-18和裂解的IL-1b)的表达,且呈剂量依赖性。图3D为细胞活力测定，发现TMP确实可以抑制HSC中PDGF刺激的增殖，并且在30μM时会产生显着的抑制作用。图3Ewesternblot
分析证明TMP剂量依赖性地降低了炎症细胞因子（pro-IL1b，proIL-18和裂解的IL-1b）的表达。图3F通过ELISA检测HSC上清液中的炎性细胞因子水平和图3G中免疫荧光实验证实了TMP剂量依赖性地降低了炎症细胞因子（pro-IL1b，proIL-18和裂解的IL-1b）的表达。
Result4：TMP降低了经PDGF处理的HSCs中的与pdgf-br介导NLRP3/Caspase1通路的干扰有关的炎性细胞因子的表达
图4A-B为分别用PDGF刺激HSC12小时和24小时，PDGF-bR及其下游信号分子NLRP3和裂解的caspase1的磷酸化增强，但抑制了pro-caspase1的表达。图4C-D为用TMP处理时检测这些信号分子（PDGF-bR/NLRP3/caspase1）的表达，结果表明TMP剂量依赖性地降低了它们的浓度，表明该途径被破坏。图4E-F为免疫荧光实验，结果表明TMP剂量依赖性地降低了它们的浓度，表明该途径被破坏。PDGF-bR抑制剂Imatinib和NLRP3抑制剂Gly用于建立TMP途径破坏与炎性细胞因子表达降低之间的联系。图4GMTS分析表明适当剂量的Gly不会影响细胞活力，但可以调节细胞内信号传导事件。图4H蛋白质印迹分析表明，与伊马替尼功能相似，选定剂量的TMP显着消除了PDGF增加的p-PDGF-bR表达。图4I蛋白质印迹分析表明，选定剂量的TMP还可以减少模仿Gly和Imatinib作用的NLRP3，裂解的caspase1和炎性细胞因子蛋白的表达。图4J蛋白质印迹分析表明，NLRP3激动剂MSU可以消除TMP对NLRP3途径中关键分子的抑制作用。这些数据表明，TMP降低了活化HSC中与PDGF-bR/NLRP3/caspase1通路破坏相关的炎性细胞因子的表达。
讨论：
肝纤维化是多种慢性肝病的常见结果，如果不进行有效治疗，会导致严重的肝功能障碍，甚至危及生命，如肝硬化和肝癌。因此，探讨肝纤维化的发病机制已引起国内外学者的广泛
