摘要
慢性肝炎（CH）进展会导致肝纤维化、肝硬化（LC）、肝细胞癌（HCC，简称肝癌）等一系列并发症的发生。乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染是这类进展性肝脏疾病的主要病因。尽管抗病毒治疗能够有效清除HCV及抑制HBV复制和再感染，但相当大比例的HBV或HCV感染者仍正在发展为LC和HCC，由HCC导致的病死率仍在以每年约3%的速率上升。
HCC的诊断延误常与不良预后、快速复发、肝内外转移及化疗耐药等事件相关。因此，早期诊断肿瘤能够显著改善患者预后。但对肝癌的诊断，尤其是血清甲胎蛋白（AFP）水平较低的患者，仍是临床面临的一大挑战。大部分HCC经典的标志物，如血清AFP、AFP异质体（AFP-L3）及异常凝血酶原（DCP）的结果并不一致。计算机断层扫描（CT）是目前诊断HCC的最佳手段，但依旧无法有效检出小型病灶。目前，尽管已有大量关于HCC生物标志物的研究，但要解决前述问题仍需HCC预后判断或早期诊断相关的标志物。
非编码RNA包括微小RNA（miRNA，长约18-22nt）、长链非编码RNA（lncRNA，长度nt）。由于存在于体液中的循环RNA在不同疾病阶段发生快速变化，因此可作为多种疾病的潜在生物标志物。近年来人们逐渐意识到，携带核酸、蛋白、脂质等活性物质的细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯过程中发挥着重要作用，外泌体即为其中的一类直径范围在40-nm的囊泡。外泌体的囊泡结构保护其包含的miRNA免受RNA酶降解，从而增强了其作为标记物的的稳定性和诊断潜能。该研究鉴别出了三种肝组织特异性的、可作为低AFP水平HCC诊断标志物的外泌体miRNA。
1.HCC肝组织及公共数据库miRNA谱的整合分析及通路分析
具体研究设计如图1所示，通过Illumina平台对HCV-HCC患者（T，n=3）及正常个体（N，n=3）的肝组织进行小RNA和总RNA的转录组分析。
图1研究设计示意图
火山图和非监督聚类分析结果显示了两组样品miRNA及mRNA的表达特征及表达量（图2a-d）。差异表达基因分析结果显示，在FDR校正后（log?foldchange≥1.5fold，P0.05，Padj=0.1），一共得到了41种在HCC肝组织中表达异常的miRNA（31种上调，10种下调）。前30%表达异常的miRNA/mRNA的表达差异倍数如图2a，2b所示。由于这部分表达异常的miRNA是在HCV-HCC组织中获得的，因此该研究进一步比对了TCGA和GEO数据库中包含HCV-HCC、HBV-HCC样本的数据集。通过分析GES（9T/7N）、GES（T/10N）获得了16种表达异常的miRNA，而对TCGA数据库中LIHC数据集HCC（T=46）和癌旁非肿瘤组织（NT=12）样品的分析则获得了50种在HCC中异常表达的miRNA。通过比较前述三种分析获得的miRNA集，最终获得了三种对HCC发展有指示意义的miRNA，分别为miR-10b，miR-，miR-21（图2e）。
接着，研究者通过TargetScan和miRWalk工具确定了这三种miRNA及其他排名靠前的异常表达miRNA的靶基因，并在TCGA及On
