前言
肝星状细胞（HSC）的活化代表了促进慢性胆汁淤积性肝病进展的主要驱动力。我们以前曾报道，胆管细胞来源的外来体长非编码RNA-H19（LncRNA-H19）在促进胆汁淤积性肝损伤中起着关键作用。然而，尚不清楚胆管细胞衍生的lncRNA-H19是否调节HSC活化，这是本研究的主要焦点。4月15日里士满弗吉尼亚联邦大学微生物学和免疫学团队在Hepatology上发表了“Cholangiocyte-derivedexosomalLncRNAH19promoteshepaticstellatecellactivationandcholestaticliverfibrosis”，文章中使用胆管结扎（BDL）和Mdr2敲除（Mdr2-/-）小鼠模型，对野生型和H19母体Exon1/+（H19KO）小鼠进行BDL，产生Mdr2-/H19maternalExon1/+（DKO）小鼠。从培养的小鼠和人胆管细胞或小鼠血清中分离的外泌体用于体内移植和体外研究，荧光标记的外泌体和流式细胞术用于监测肝细胞的外泌体摄取，胶原凝胶收缩和BrdU测定用于确定外泌体H19对HSC活化和增殖的影响。通过实时PCR、Western印迹分析、组织学和免疫组织化学分析小鼠和人原发性硬化性胆管炎（PSC）/原发性胆汁性胆管炎（PBC）肝脏样品。结果表明，肝脏H19水平与小鼠模型和人PSC和PBC患者的肝纤维化严重程度密切相关。H19缺陷保护小鼠免于BDL和Mdr2-/-小鼠的肝纤维化，移植的胆管细胞衍生的富含H19的外泌体快速且优先被HSC和HSC衍生的成纤维细胞摄取，并在BDL-H19KO小鼠和DKO小鼠中促进肝纤维化。富含H19的外泌体增强了培养的小鼠原代HSC的转分化，并促进了HSC衍生的成纤维细胞中的增殖和基质形成。
研究思路
Figure1：胆汁淤积小鼠模型和人PSC和PBC患者中肝H19和纤维化标志物基因表达的相关性。通过实时RT-PCR测量mRNA水平，并使用Hprt1作为内部对照标准化。将H19的相对mRNA水平分别与CK19，ACTA2，LOXL2或胶原蛋白1的相对mRNA水平作图。（A）两周BDLWT小鼠;（B）天龄的Mdr2-/-小鼠;（C）PSC患者;（D）PBC患者。
Figure2：胆汁淤积细胞是胆汁淤积条件下外泌体H19的主要来源。从（A）3天和7天WTBDL小鼠或假对照小鼠或（B）不同年龄的WT和Mdr2-/-小鼠分离原代肝细胞，胆管细胞，肝星状细胞（HSC）和库普弗细胞。通过实时RT-PCR测定来自每组的不同原代细胞中H19的相对mRNA水平，并使用Hprt1作为内部对照标准化。相对于假对照或WT小鼠的统计学显着性;相对于3天BDL或60天Mdr2-/-小鼠;相对于肝细胞，测量来自（C）7天BDL小鼠或（D）天Mdr2-/-小鼠的血清外泌体中的H19水平，并使用18SRNA作为内部对照标准化。（E）显示了靶向H19的FISH的代表性图像。（F）显示了靶向CK19和CD63的免疫荧光的代表性图像。
Figure3：H19缺乏减少BDL小鼠和Mdr2-/-小鼠的纤维化肝损伤。（A-C）将WT和H19KO小鼠进行假手术或BDL两周。（A）显示了Masson三色染色的代表性图像和针对CK19和α-SMA的免疫组织化学染色。（B）肝羟脯氨酸水平。（C）通过实时RT-PCR测定各组的肝Acta2，Loxl2，Collagen1，Tgf-β和Ck19的相对mRNA水平，并使用Hprt1作为内部对照标准化。（D-F）WT，H19KO，Mdr2-/-和DKO小鼠在天龄时处死。（D）显示Masson三色染色的代表性图像和针对CK19和α-SMA的免疫组织化学染色。（E）肝羟脯氨酸水平。（F）测定肝纤维化标志物基因和Ck19的相对mRNA水平。
Figure4：富含H19的外泌体在H19-/-BDL小鼠和DKO小鼠中促进肝纤维化。（A）实验方案。（B）通过实时RT-PCR测定各组的肝Acta2，Loxl2，Collagen1，Tgf-β和Ck19的相对mRNA水平，并使用Hprt1作为内部对照标准化。（C）显示Masson三色染色的代表性图像和针对CK19和α-SMA的免疫组织化学染色。测定肝脏羟脯氨酸水平。（D-F）从天龄WT小鼠（Ct-SExo）或Mdr2-/-小鼠分离血清外泌体。DKO小鼠通过尾静脉在9周龄时注射外泌体。（D）实验方案。（E）肝纤维化基因和Ck19的相对mRNA水平。（F）显示了Masson三色染色的代表性图像和针对CK19和α-SMA的免疫组织化学染色。
Figure5：HSC对MLE衍生的外泌体的摄取。（A）显示了IRDye标记的外泌体的器官分布的代表性图像。（B）监测原代肝细胞，1天培养的原代HSC，7天培养的HSC衍生的成纤维细胞和库普弗细胞对PKH26标记的外泌体的时间依赖性摄取。（C）向WT小鼠注射染料对照或PKH26标记的MLE衍生的外泌体。使用流式细胞术分析，使用细胞类型特异性表面标志物监测每种类型肝细胞的外泌体摄取。（D）显示了培养1天或7天的原代小鼠HSC摄取的PKH26标记的外泌体的代表性图像。
Figure6：源自胆管细胞的外泌体H19促进HSC活化。（A）显示了在第1,3,5和7天HSC的细胞形态变化的代表性图像和统计学分析。（B）通过实时RT-PCR测量HSC转分化期间肝Acta2，胶原蛋白1和Loxl2的相对mRNA水平，并使用Hprt1作为内部对照标准化。（C）用Ct-MLE-Exo或H19OE-MLE-Exo处理HSC衍生的成纤维细胞24小时.（D）含有HSC衍生的成纤维细胞的胶原凝胶每隔一天用Ct-MLE-Exo或H19OE-MLE-Exo处理或不处理。（A-D）相对于Ct-MLE-Exo组的统计学显着性。（E和F）从对照MLE和H19KD-MLE分离外泌体，其用E2，TCA或媒介物对照处理。（E）如所示处理HSC衍生的成纤维细胞。通过实时RT-PCR测定Acta2，Collagen1，Lox12，纤连蛋白，Pdgfrβ和Tgf-β的相对mRNA水平，并使用Hprt1作为内部对照标准化。（F）来自3个独立实验的代表性胶原凝胶图像。（E和F）相对于Ct-MLE-Ct-Exo组的统计学显着性。
Figure7：来源于胆管细胞的外泌体H19促进HSC增殖。（A和C）通过BrdU测定监测细胞增殖。显示了BrdU测定的代表性图像。（B和D）显示了通过CellometerVisionCBA分析系统测定的相对细胞数和细胞周期分析。（E和F）通过蛋白质印迹分析测定细胞周期蛋白D1和p21的相对蛋白质水平，并使用β-肌动蛋白作为上样对照进行标准化。（B和E）相对于Ct-MLE-Exo组的统计学显着性。（D和F）相对于Ct-MLE-Ct-Exo组的统计学显着性，
结论
胆管细胞是胆汁淤积性肝病的主要目标，包括PSC和PBC。胆汁流的阻塞导致胆汁酸的积累，其不仅导致肝细胞损伤和慢性炎症，而且还诱导以胆管细胞增殖和胆管增生为特征的导管反应。已经确定异常炎症诱导HSC的活化并促进肝纤维化进展。然而，胆管细胞是否以及如何影响HSC转分化或激活仍有待完全阐明。最近报道了lncRNA，这是20世纪80年代发现的第一个非编码RNA，在Mdr2-/-小鼠模型的胆汁淤积性肝损伤过程中在胆管细胞中被显着诱导，并导致Mdr2缺陷诱导的肝损伤的性别差异。在目前的研究中，显示胆管细胞来源的lncRNAH19在激活HSCs和促进胆汁淤积性肝纤维化中起关键作用。
提出的机制示意图，该机制是胆汁细胞来源的外泌体H19对胆汁淤积性肝纤维化期间HSC活化和增殖的促进作用的基础。
lncRNAH19是父系印记和母系表达的，并且通过H19基因中印迹控制区的差异甲基化进行基因组印记调节。在正常生理条件下，H19在出生后除骨骼肌外的所有组织中均下调。H19的异常表达与包括肝癌在内的各种癌症有关。在这里，进一步证实胆管细胞是生理和胆汁淤积条件下肝脏H19的主要来源，采用三种不同的方法，包括原发性胆管细胞的免疫纯化，激光捕获显微切割和FISH-IHC测定。有趣的是，在BDL和Mdr2-/-小鼠模型中，其中胆管细胞是主要靶标，H19主要在胆管细胞中诱导。然而，在CCl4诱导的肝纤维化模型中，其中肝细胞是主要靶标，仅在肝细胞中观察到H19诱导，而在胆管细胞中未观察到H19诱导。考虑到H19在发育和细胞增殖中发挥的关键作用，这些结果强烈表明H19过表达是响应肝脏细胞损伤的适应性机制。此外，回归分析表明，肝脏H19表达水平与肝纤维化的严重程度相关。
外泌体是由各种类型的细胞释放的小细胞外载体，其可携带多种货物，包括蛋白质，DNA，mRNA，miRNA，lncRNA和脂质。最近，外泌体在生理和病理条件下作为细胞间通讯的必要介质引起了极大的
