来源：中华肝脏病杂志
作者：邓羊羊葛善飞余燕青
摘要
目的
探讨肝细胞核因子（HNF）1α在慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达与肝组织炎症和纤维化发生、发展的关系。
方法
选择年至年诊治的慢性乙型肝炎患者64例，患者均已在超声引导下行肝穿刺活组织检查术，收集其肝穿刺病理学结果进行炎症分级及纤维化分期；收集穿刺肝组织蜡块进行切片，采用免疫组织化学染色法检测HNF1α在肝组织中的表达情况。双向有序分组资料采用Mantel-Haenszelχ2检验，等级相关性分析采用Spearman等级秩相关性检验。
结果
慢性乙型肝炎患者肝组织呈现出不同程度的炎症坏死及纤维化，HNF1α表达与肝组织炎症水平分级存在线性关系（χ2MH=40.70，P0.05），慢性乙型肝炎患者肝组织炎症水平越高，HNF1α在肝组织中的表达越弱，HNF1α表达强度与炎症分级呈负相关（rs=-0.，P0.05）；HNF1α表达与肝组织纤维化程度分期存在线性关系（χ2MH=31.95，P0.05），随着肝纤维化程度加重，HNF1α在肝组织中的表达水平逐渐降低，HNF1α表达强度与纤维化分期呈负相关（rs=-0.，P0.05）。
结论
HNF1α与肝组织炎症及纤维化的发生、发展密切相关，有望成为评价慢性乙型肝炎患者肝组织炎症及纤维化水平的敏感指标，其表达下调可能参与了肝脏炎症及肝纤维化发生、发展的过程，有可能成为慢性肝炎治疗的新靶点。
肝细胞核因子1α（hepatocytenuclearfactor1-alpha，HNF1α）是HNFs家族的主要成员之一，主要在肝脏中表达，是许多肝脏基因的转录激活因子，对肝细胞的分化成熟及维持正常肝细胞功能至关重要[1,2,3]。有研究报道，靶向抑制肝细胞中HNF1α的表达，导致了一系列炎症信号通路的激活，并加重了正常肝细胞的损伤及肝纤维化程度[4]。本课题组前期研究结果表明，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，HNF1αmRNA及蛋白表达水平随着肝纤维化水平的加重而逐步下降[5]。慢性乙型肝炎（chronichepatitisB，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染所致的常见慢性肝病，其中慢性肝脏炎症导致肝损伤，促使肝纤维化形成，最终可进展为肝硬化甚至肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）。在CHB患者肝脏炎症及纤维化进展过程中，既往对HNF1α的研究较少，HNF1α所扮演的角色尚不明确，且关于HNF1α在CHB患者中的作用机制、分子学特征尚未完全明确。本研究通过免疫组织化学染色法对CHB患者肝穿刺组织的观察，了解HNF1α在CHB患者肝脏炎症及纤维化发生、发展过程中的表达变化情况，探讨其作为临床反映CHB患者肝组织损伤及纤维化水平敏感指标的可能性。
资料与方法
1．研究对象：
年9月至年10月在医院就诊的CHB患者64例，其中男性52例，女性12例，年龄15～59岁，平均31岁，所有患者的诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（更新版）》[6]中的诊断标准，并排除其他各类原因所致的肝损害，且均已在超声引导下行肝穿刺活组织检查术，收集其肝穿刺病理学结果及肝穿刺组织蜡块。另有3例慢性HBV携带者因肝脏良性病变而行手术治疗的正常肝组织作为对照。
2．肝活组织病理学检查：
送检肝组织长度≥1.0cm，镜下可评价汇管区≥3个，病理学检测包括常规HE染色及Masson染色(评价纤维化情况)，上述指标均由一位病理学专家完成病理学诊断及评估，所有标本均满足诊断要求。组织病理学诊断、肝组织炎症坏死的分级及纤维化程度的分期按慢性肝炎分级标准中的病理诊断标准进行[7]：炎症坏死分级（Grading，G）为G0～G4，G0～1为轻度炎症，G2为中度炎症，G3～4为重度炎症；纤维化程度分期（Staging，S）为S0～S4，S0～1为轻度纤维化，S2为中度纤维化，S3～4为重度纤维化。将CHB分为轻度CHB（G1～2S0～2）、中度CHB(G3S1～3)、重度CHB（G4S2～4）。
3．免疫组织化学染色
（1）试剂：鼠抗人HNF1α单克隆抗体（规格：原液25μl），购自美国GeneTex公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、3%H2O2溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）及EDTA抗原修复液（pH9.0）均购自无锡傲锐东源生物科技有限公司。
（2）实验方法：用切片机对肝穿刺组织蜡块进行切片，切片厚度为3μm，固定于载玻片上；切片置于电热恒温鼓风干燥箱中进行烤片，80℃20min；经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。高压锅中，加入抗原修复液EDTA（pH9.0）进行高温高压抗原修复。用3％H2O2溶液清除内源性过氧化物酶。滴加适当抗人HNF1α单克隆抗体（1∶稀释），室温下置于免疫组织化学染色孵育盒进行孵育2h，用PBS浸泡清洗3min×3次。滴加适当羊抗鼠/兔IgG聚合物第二抗体，室温下置于免疫组织化学染色孵育盒进行孵育20min，用PBS浸泡清洗3min×3次。滴加DAB显色剂进行显色。用自动免疫组织化学复染机进行复染，中性树胶封片。以慢性HBV携带者正常肝组织切片作阳性对照。
（3）结果判读：由一位病理学专家在光镜下读片，每张切片随机选取5个视野（×）进行评分后取其平均分值，采用阳性细胞比率、染色强度二项指标进行评分，总积分＝阳性细胞比率评分＋染色强度评分：０～１分为阴性（-），２分为弱阳性（＋），3～4分为中强阳性（＋＋），5～6分为强阳性（＋＋＋）。阳性细胞比率评分：阳性细胞数占总细胞数10％为０分，阳性细胞数占总细胞数10％～25％为1分，阳性细胞数占总细胞数25％～50％为2分，阳性细胞数占总细胞数50％为3分。染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。本实验结果按其表达强度表示为阴性（-）、弱阳性（+）、中强阳性（++）、强阳性（+++）4种等级。
4．统计学方法：
所有数据应用SPSS19.0软件包进行统计学分析，双向有序分组资料采用Mantel-Haenszelχ2检验，等级资料相关性分析采用Spearman等级秩相关检验，以P0.05为差异具有统计学意义。
结果
1．肝组织病理学表现：
肝组织HE及Masson染色显示：慢性HBV携带者组肝小叶结构正常，未见明显肝细胞变性、坏死及纤维化组织；轻度CHB组肝小叶结构保留，可见肝细胞变性，少数点、灶状坏死或凋亡小体，汇管区有轻度纤维组织增生；中度CHB组肝小叶结构紊乱，可见肝细胞变性,有明显的点、灶状坏死，汇管区有较多纤维组织增生；重度CHB组肝小叶结构消失，可见假小叶形成,呈碎屑样坏死，汇管区有明显纤维组织增生并形成纤维间隔。见图1。
2．免疫组织化学染色：
HNF1α广泛分布于肝细胞质中，肝细胞核中也可见阳性表达。慢性HBV携带者正常肝组织的切片表现为胞质和胞核呈强阳性染色，HNF1α表达强度高（图2A）；轻度炎症（G0～1）肝组织中HNF1α表达强度较高，表现为大多数胞质和胞核呈棕褐色（图2B），中度炎症（G2）肝组织中HNF1α表达强度介于轻、重之间，表现为大多数胞质和胞核呈棕黄色（图2C），重度炎症（G3～4）肝组织中HNF1α表达强度较低，表现为大多数胞质和胞核未着色或仅呈淡黄色（图2D）；轻度纤维化（S0～1）肝组织中HNF1α表达强度较高，表现为大多数胞质和胞核呈棕褐色（图2E），中度纤维化（S2）肝组织中HNF1α表达强度介于轻、重之间，表现为大多数胞质和胞核呈棕黄色（图2F），重度纤维化（S3～4）肝组织中HNF1α表达强度较低，表现为大多数胞质和胞核未着色或仅呈淡黄色（图2G）。
3．HNF1α在CHB患者肝脏中的表达：
（1）不同炎症水平肝组织中HNF1α的表达：Mantel-Haenszelχ2检验结果提示：HNF1α表达与肝组织炎症水平分级存在线性变化趋势（χ2MH=40.70，P0.05），肝组织炎症水平越高，HNF1α在肝组织中的表达越弱（表1）。
（2）不同纤维化程度肝组织中HNF1α的表达：Mantel-Haenszelχ2检验分析提示：HNF1α表达与肝组织纤维化程度分期存在线性变化趋势（χ2MH=31.95，P0.05），随着肝纤维化程度加重，HNF1α在肝组织中的表达水平逐渐降低（表2）。
（3）肝组织中炎症分级、纤维化分期与HNF1α表达强度的等级相关性分析：Spearman等级秩相关性分析结果提示：HNF1α表达强度与炎症分级呈负相关（rs=-0.，P0.05）；HNF1α表达强度与纤维化分期呈负相关（rs=-0.，P0.05）。
讨论
CHB是由HBV感染所致的一种常见慢性肝病，长期的HBV感染可导致慢性肝脏炎症，促进肝纤维化形成，进而导致肝硬化、肝衰竭甚至HCC。本研究通过对CHB患者肝组织的病理学检测显示：CHB患者肝组织呈现出不同程度的炎症坏死及纤维化，与近期的研究结果一致[8]。早期肝纤维化是一种可逆性的病变。在人类研究结果和动物模型都很好地证实了肝纤维化是一个可以通过阻止进展来调节的动态过程[9]。针对慢性乙型肝炎，合理有效的抗病毒治疗可以减缓甚至逆转部分肝纤维化，但仅有少部分患者肝硬化可逆转[10]。因此，采取有效手段对CHB患者进行病情评估，尽早采取干预措施以阻止肝纤维化进展显得尤为重要。
目前普遍认为，肝纤维化是由于肝组织内细胞外基质（extracellularmatrixc，ECM）的生成与降解失衡，大量ECM沉积在肝组织所致。活化的肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSCs）是产生ECM的主要细胞，肝细胞炎症因子促进HSCs的活化，进而导致肝纤维化和肝硬化，HSCs的活化是肝纤维化的中心环节[11,12,13]。姚荔嘉等[14]指出，特异性上调肝细胞HNF1α的表达可抑制HSCs的活化，说明HNF1α可能通过抑制HSCs活化发挥抗肝纤维化作用。
既往有研究结果表明，通过特异性敲除HNF1α基因的模型小鼠，伴随着脂肪酸合成增加及肝纤维化程度加重，最终导致HCC发生，说明肝细胞HNF1α表达受抑制促进了肝纤维化的发生[15]。姚荔嘉等[14]发现，在构建的小鼠肝纤维化模型中，HNF1α的表达水平下降，而特异性上调肝细胞的HNF1α表达可显著降低小鼠纤维化肝脏中的I型胶原蛋白及α-平滑肌肌动蛋白水平。相反，通过靶向抑制肝细胞中HNF1α的表达，可激活P65、核因子-κB和JAK/STAT炎症信号通路，并加重正常肝细胞的损伤及纤维化程度[4]，证实了HNF1α在肝脏中的抗炎及抗纤维化效应。本课题组前期研究结果表明，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，HNF1αmRNA及蛋白表达水平随着肝纤维化水平的加重而逐步下降[5]。本研究通过采取免疫组织化学染色法对CHB患者的肝穿刺组织观察显示：HNF1α的表达水平随着肝脏炎症及纤维化程度加重而逐渐降低，表达强度与肝脏炎症水平分级及纤维化程度分期呈显著负相关，提示HNF1α在肝脏炎症及纤维化发生、发展过程中可能起到抑制作用，进一步验证了姚荔嘉等[14]的结论。
综上所述，HNF1α与肝组织炎症及纤维化的发生、发展密切相关，有望作为临床反映CHB患者肝组织炎症及纤维化水平的敏感指标。本研究结果提示，HNF1α很有可能是肝脏损伤及肝纤维化的抑制因子，其表达下调可能参与了肝脏炎症及肝纤维化发生、发展的过程。因此，鉴于HNF1α可改善肝脏损伤及肝纤维化的特性，HNF1α有可能成为慢性肝炎治疗的新靶点，这为我们开发特异性提高肝脏HNF1α水平的靶向药物，使其临床上改善慢性HBV感染所致的肝损伤及肝纤维化，减少肝硬化及肝癌的发生提供了一种新的治疗思路。然而，由于本次研究病例样本数较少，尚需更大样本、更进一步的研究以阐明HNF1α的生物学特征及其与慢性肝损伤、肝纤维化发生和发展的关系，以及其作用的分子机制。
参考文献
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