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-02-22
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背景：
肝脏是一个独特的器官，在急性/慢性损伤或部分肝切除术后表现出修复性和再生反应，所有类型的细胞都必须增殖以重建肝脏。NADPH氧化酶NOX4介导转化生长因子(TGF-β)的作用，包括肝细胞凋亡和星状细胞对肌成纤维细胞的激活。本研究的目的是通过两个NOX4基因敲除的小鼠模型分析其对肝脏再生的影响:普通敲除(NOX4-/-)和NOX4肝细胞特异性敲除(NOX4hepKO)。分析2/3部分肝切除术(PH)后肝再生情况。
简介：
年12月，来自西班牙国家肝脏和胃肠道疾病生物医学研究所的I.Fabregat教授课题组在RedoxBiol（一区）杂志上发表题为“NADPHoxidase4(Nox4)deletionacceleratesliverregenerationinmice”的文章[1]。该研究发现，与相应的野生型小鼠相比，NOX4-/-和NOX4hepKO小鼠的肝体重比恢复得更早，存活率也更高。NOX4缺失肝脏再生肝细胞脂肪堆积和实质组织恢复较快。通过Ki67和phospho-Histone3免疫组化分析，在NOX4缺失小鼠中，肝细胞增殖加速和增加，与Myc早期和增加表达一致。
主要结果：
Nox4缺失加速肝脏质量恢复和实质构建。
作者首先证实，用于培育和获得NOX4hepKO小鼠的野生型小鼠NOX4floxp+/+小鼠中，Nox4mRNA水平发生了下降。接下来我们分析了Nox4缺失如何影响Nox基因家族其他成员的肝脏表达。各组中，WT和KO小鼠的Nox2表达均无显著差异，且Nox2表达下降。当作者分析肝部分切除（PH）后不同时间的肝脏/体重比时，作者发现与相应的WT小鼠相比，NOX4/和NOX4hepKO小鼠的肝脏/体重比均出现了显著的提前恢复，这与NOX4-/-小鼠PH值后显著更高的存活率相关。HE染色也显示肝脏实质结构较早恢复。
图1：2/3PH后，WT和NOX4-/-小鼠的肝脏/体重、小鼠存活率和实质结构分析
在2/3PH后，NOX4hepKO小鼠肝细胞增殖加速和增加。
为了分析在缺失Nox4表达的情况下，肝细胞的增殖反应是否发生了改变，对作为增殖细胞周期标记物的Ki67进行了免疫组化分析，phospho-Histone3是NOX4hepKO模型中更特异的G2/M期标记物。结果显示，与NOX4floxp+/+相比，在PH值后48和72h,NOX4hepKO染色的肝细胞数量显著增加。为了更好地探索肝细胞的增殖能力，从未切除肝的小鼠中分离肝细胞并培养，以评估其对胎牛血清的反应。有趣的是，极低浓度的胎牛血清(2%)可使NOX4hepKO细胞在24小时内增加近40%的活细胞数量，显著高于NOX4floxp+/+肝细胞。这种增加与细胞周期蛋白D1(Ccnd1)、细胞周期蛋白A2(Ccnd2)和细胞周期蛋白B2(Ccnb2)的表达显著增加相关。
肝再生加速与早期诱导Myc表达相关。
与相应的野生型小鼠相比，NOX4-/-小鼠的肝脏在PH后24h，以及在PH后24和36h,Myc的表达均有更高的增加。Westernblot和免疫组化分析显示，NOX4-hepKO肝细胞PH后36hc-Myc蛋白水平显著升高，c-Myc阳性核明显增加，证实了mRNA水平的差异。有趣的是，原代培养的WT肝细胞和PH后30小时的NOX4-/-小鼠肝细胞，在对胎牛血清或者含有胎牛血清、胰岛素、氢化可的松和表皮生长因子的有丝分裂混合物的反应中，NOX4/肝细胞中MycmRNA水平显著升高。
图2：WT和NOX4-/-小鼠PH后肝脏的转录组RNA-seq分析
RNA-seq分析显示，与WT小鼠相比，PH后NOX4-/-的转录组发生了显著变化。
为了更好地理解引起在NOX4缺失小鼠中肝脏再生的加速和Myc表达的差异的分子机制，作者在PH后6小时、24小时、48小时和小时对WT和NOX4/小鼠的肝脏样本进行了RNA-seq分析。结果显示，WT和NOX4-/-之间的基因表达存在显著差异，尤其是在PH后24小时。基因本体(GO)富集分析24h差异表达(DE)基因显示，其中一个显著富集的通路是对含氧化合物的响应，Myc的表达在PH值后6小时在WT和NOX4-/-肝脏中均出现上调，但在24小时后，只有NOX4-/-肝脏的PH维持在高水平，而在WT肝脏中，Myc的表达在基础水平上下降。在与Myc连接的富氧反应网络中出现的其他相关增殖相关基因，如Egr1、Sox9、Jund和Fosb等，在24小时内也观察到这种差异表达模式。该部分实验发现，TGF-β通路在WT和NOX4-/-小鼠中可随时间差异激活。
图3：从WT和NOX4-/-肝脏分离的原代肝细胞对TGF-β的反应
在PH后，Nox4-/-和NOX4hepKO肝脏中TGF-β通路的衰减更早、更明显。
成熟的、活性的TGF-β1的免疫组化分析显示，TGF-β1在WT肝组织中明显升高，但在NOX4-/-中明显降低，而在NOX4-HepKO中，在PH后24和36h,TGF-β1的升高幅度很小。肝组织免疫组化分析表明，这与NOX4-/-和NOX4HepKO中Smad3阳性核的数量减少有关。值得注意的是，从WT和NOX4-/-小鼠中原代分离的肝细胞对外源性TGF-β1抑制FBS诱导的细胞周期蛋白表达增加和肝细胞增殖的反应是正确的，从细胞数量或Ki67+细胞的角度分析，无论NOX4是否表达。NOX4-/-肝细胞c-Myc水平在基础水平和胎牛血清反应中较高，但TGF-β1在WT和NOX4-/-肝细胞中抑制其上调的能力相同。这些结果表明，TGF-β1诱导的细胞周期生长抑制并不是Nox4所必需的。
结论：
NOX4通过介导TGF-β在肝纤维化中的作用，被认为是人类肝脏慢性疾病的潜在治疗靶点。本文提出的结果将支持其抑制的潜在好处，也有利于剩余的健康肝细胞的肝再生。Nox4似乎对终止肝再生并不重要，这加强了其作为治疗靶点的潜力，且没有副作用。然而，考虑到抑制NOX4在肿瘤前条件下可能是有害的，在肝脏慢性炎症和纤维化的早期阶段必须考虑NOX4抑制。
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