来源：中华肝脏病杂志
作者：潘丽莎华美云徐思雅
摘要
目的
通过小鼠动物模型探讨维生素D对急性肝衰竭肝脏的保护作用。
方法
应用D-氨基半乳糖（D-GalN）联合脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肝衰竭模型，观察长期维生素D缺乏对肝脏损伤、肝脏炎症信号的影响。采用硫代乙酰胺（TAA）诱导的小鼠急性肝衰竭模型，观察维生素D缺乏对模型小鼠存活率的影响，并观测补充高剂量维生素D对模型小鼠的保护作用。通过测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸氨转氨酶（AST）以及苏木精-伊红染色评估肝组织病理变化；通过RT-qPCR检测肝脏组织肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3（NLRP-3）以及趋化因子CCL2、CXCL1、CXCL2等的表达；通过免疫组织化学检测肝脏组织巨噬细胞的数量。组间比较采用t检验，生存曲线采用Log-rank（Mantel-Cox）分析。
结果
长期维生素D缺乏饲养会增加小鼠对急性肝损伤的敏感性，表现为增加血细胞外渗、肝脏实质细胞大量坏死，上调肝脏组织TNF-α、IL-1β、NLRP-3的mRNA表达（P0.05）；并增加肝脏巨噬细胞的数量（P0.05）。同时，维生素D缺乏会增加小鼠因肝损伤造成的病死率（P0.01）。相反，预先给予大剂量维生素D（IU/g）可以明显减轻小鼠的肝损伤，抑制ALT、AST的上升（P0.01），缓解肝脏组织坏死，同时下调肝脏组织炎症因子的mRNA表达（P0.05）。
结论
小鼠模型显示长期维生素D缺乏会加重药物导致的急性肝衰竭，降低存活率；而给予高剂量维生素D具有一定肝脏保护作用，可显著改善肝脏的坏死情况并抑制炎症。因此，充足的维生素D可维持肝脏的生理平衡以抵御肝损伤。
急性肝衰竭（acuteliverfailure，ALF）的病因包括病毒感染、药物滥用等[1-3]。这些因素都会造成肝实质细胞损伤，激活固有免疫系统如枯否细胞、自然杀伤细胞[3]，后者能够释放大量炎症细胞因子和趋化因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、细胞趋化因子（CXCL2），从而进一步扩大肝脏损伤的范围[4-7]。大范围的急性肝损可严重影响其他主要器官的功能，使病情迅速进展[7]。于是，缓解肝实质细胞的损伤、抑制过度的炎症风暴对于控制ALF的进展起着重要作用。维生素D（vitaminD，VD）不仅促进钙磷在小肠吸收，更具广泛的生理调节功能[8]。例如，通过其细胞核受体（vitaminDreceptor），维生素D信号能促进调节性T细胞（regulatoryTcells），抑制Th-1、Th17应答，从而平衡免疫系统[9]。此外，维生素D信号也可通过促进Paneth细胞分泌防御素来平衡小肠的固有免疫系统[10]。相反，长期维生素D缺乏则可引起慢性炎症，引发脂肪肝和肝纤维化[11-12]。更有临床调查表明，低浓度的维生素D水平与ALF的严重程度显著相关[13]。基于此，我们推测长期维生素D缺乏可能加重ALF，补充维生素D可能通过平衡免疫功能来预防/改善ALF。于是，本研究采用ALF小鼠模型，并通过缺乏维生素D（vitaminDdeficiency，VDD）和补充维生素D两种方法证实维生素D对ALF的肝脏保护作用。
材料与方法
1．实验试剂及仪器：
D-氨基半乳糖（D-GalN）购自阿拉丁公司；脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）购自德国Sigma公司；AIN93饲料（富含维生素D3，0IU/kg）、VD3缺乏饲料购自华阜康生物科技股份公司；维生素D2注射液购自江西赣南海欣药业股份有限公司；反转录试剂盒购自瑞士Roche公司、荧光定量PCR试剂盒购自Novoprotein公司；F4/80抗体购自NovusBiologicals公司；小鼠血清25羟基维生素D的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自英国艾狄斯公司；q-PCR仪购自Bio-Rad公司；数字病理扫描仪购自日本滨松公司。
2．实验动物来源：
无特定病原级雄性BALB/c小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，4~6周龄，体质量15~20g。
3．长期维生素D缺乏对急性肝衰竭模型小鼠的影响：
24只小鼠，适应环境1周后，随机分为4组，每组5~7只：（1）对照组（CTRL）以含标准VD3的饲料喂养；（2）维生素D缺乏组（VD3缺乏饲料喂养，VDD）；（3）给予对照饲料急性肝损伤组（CTRL+D-GalN/LPS）；（4）维生素D缺乏饲养条件下急性肝损伤组（VDD+D-GalN/LPS）。在以富含维生素D或者缺乏维生素D饲料喂养16周后，给予其中2组以腹腔注射D-GalN0.7mg/g和LPS50ng/g，而另外两组给予同等量的等渗盐水。在注射后6h处死小鼠，收取血液和肝脏组织，测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）浓度。并通过苏木精-伊红（HE）染色检测小鼠肝脏的病理变化、通过免疫组织化学检测肝脏F4/80阳性细胞数量、通过RT-qPCR检测肝脏炎症因子的表达水平。
4．维生素D缺乏对急性肝衰竭模型小鼠存活率的影响：
52只小鼠，适应环境1周后随机分为4组，其中（1）对照组（标准VD3饲料喂养3周，CTRL，n=6）；（2）维生素D缺乏组（VD3缺乏饲料喂养3周，VDD，n=6）；（3）对照+急性肝损伤组（CTRL+TAA，n=20）；（4）维生素D缺乏+急性肝损伤组（VDD+TAA，n=20）。通过给予小鼠腹腔注射μg/gTAA以造成肝损伤，或者给予同等量的等渗盐水作为对照。观察小鼠存活状态，每12h记录小鼠死亡数量，总计观察96h。
5．给予高剂量维生素D2，测定对急性肝衰竭模型小鼠的保护作用：
31只小鼠，适应环境1周后随机分为4组。各组小鼠均饲以正常饲料喂养，其中2组给予高剂量VD2（IU/g腹腔注射维生素D2注射液），或者注射同等量的菜籽油。1周后，其中2组给予腹腔注射TAAμg/g，另2组腹腔注射同等量的等渗盐水。注射6h后处死小鼠，收集血液、肝脏，测定血清ALT、AST浓度，并通过HE染色检测小鼠肝脏的病理变化、qPCR检测肝脏炎症因子表达。
6．统计学方法：
所有实验数据均以±s表示，并通过GraphPadPrismsoftwareV6进行统计学分析。其中，生存曲线采用Log-rank(Mantel-Cox)分析，组间比较采用t检验进行分析。P0.05为差异具有统计学意义。
结果
1．长期维生素D缺乏会加重急性肝衰竭模型小鼠的肝脏损伤：
对小鼠血清ALT和AST进行检测，我们发现D-GalN联合LPS造模成功，小鼠肝脏功能受损明显，ALT、AST显著升高（P0.05）。VDD会明显加剧肝毒性药物诱导的ALT、AST的升高（图1A）；但组间差异无统计学意义。对小鼠肝脏组织进行HE染色发现，D-GalN联合LPS造模的小鼠肝脏组织出现大规模的肝脏实质细胞病变，表现为片状凝固性坏死，伴有大量血细胞的渗出，以及炎性细胞的浸润；而VDD会加剧模型小鼠肝脏的坏死和出血（图1B）。以上结果说明，长期维生素D缺乏会加重ALF模型小鼠的肝脏损伤。相反，富含维生素D的饮食（AIN93）能够部分抵御药物导致的肝衰竭。
2．长期维生素D缺乏会促进急性肝衰竭小鼠肝脏炎症因子的表达：
RT-qPCR结果显示，长期维生素D缺乏会显著加剧ALF模型小鼠肝脏组织中炎症因子的表达，TNF-α、IL-1β、NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3（NLRP-3）在mRNA水平明显升高（图2A）。肝脏组织F4/80免疫组织化学结果显示，单纯的VDD并不影响枯否细胞（棕黄色）的数量，但在ALF造模组中，VDD会促进枯否细胞的增多（图2B）。对20倍视野下的10个图进行阳性细胞的计数发现，各组小鼠枯否细胞数量多少依次为：VDD+ALF组ALF组VDD组≈CTRL组（图2C）。以上结果说明，长期维生素D缺乏上调了ALF模型小鼠肝脏炎症相关因子的表达。
3．维生素D缺乏会显著降低急性肝衰竭模型小鼠的存活率：
根据ALF模型小鼠的死亡情况绘制出生存曲线（图3），结果显示单纯的VDD并不影响小鼠存活率。TAA造模的ALF小鼠（CTL-TAA）在96h内病死率为9%（2/22）；而在维生素D缺乏的条件下，由TAA造模的ALF小鼠（VDD-TAA），在96h内病死率接近50%（9/19），且两组间存活曲线差异有统计学意义（P0.01）。这说明，维生素D缺乏显著降低了ALF模型小鼠的存活率。
4．给予高剂量维生素D能减轻急性肝衰竭模型小鼠肝脏损伤：
提前补充高剂量VD2明显减轻了模型小鼠ALT、AST的升高程度（P0.01），见图4A。对各组小鼠肝脏组织进行HE染色发现，TAA造模的ALF模型小鼠肝脏组织出现大面积坏死，并有炎性细胞的浸润，而提前补充高剂量VD2则显著减轻了模型小鼠肝脏的坏死情况（图4B）。以上结果表明，提前补充高剂量的维生素D能减轻ALF模型小鼠的肝脏损伤。
5．给予高剂量维生素D能下调急性肝衰竭模型小鼠肝脏炎症相关因子的表达：
RT-qPCR结果显示，与对照组相比，TAA造模组小鼠肝脏炎症因子TNF-α、IL-1β及趋化因子CCL2、CXCL1、CXCL2的mRNA表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P0.05）；与直接TAA造模组相比，补充高剂量维生素D+TAA造模组小鼠肝脏促炎因子TNF-α、IL-1β、CCL2、CXCL1、CXCL2的mRNA表达水平则被显著下调（P0.05），见图5。这说明，提前补充高剂量的维生素D能够下调ALF模型小鼠肝脏炎症相关因子的表达。
讨论
ALF的发病机制尚不完全清楚，但炎症对ALF的进展具有促进作用[6,14-15]，目前已有研究尝试利用具有抗炎功效的药物来进行ALF的治疗[16]。维生素D是肌体产生的甾体类多功能生理调节因子。在充足的阳光照射下，皮肤细胞将脱氢胆固醇转化为维生素D3。同样，植物细胞中也能产生类似结构、同等生物活性的维生素D2。通过血液循环，在肝细胞中维生素D3或维生素D2发生25-羟基化，然后在肾脏中发生1-羟基化，形成1，25-2羟基维生素D，即骨化三醇（calcitriol）。通过靶细胞中的维生素D受体（VDR），骨化三醇能促进很多基因的表达[9]。在肠道细胞中维生素D信号能促进钙、磷转运受体的表达。近年来，越来越多的研究证实，维生素D还具有调节免疫的功能。一方面，维生素D可以调节免疫细胞和炎症细胞如树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞、淋巴细胞等的激活、增殖和分化[17]。另一方面，维生素D信号也可以抑制Ⅰ型促炎细胞因子如IL-6、TNF-α，增加Ⅱ型抗炎细胞因子如IL-4、IL-10的产生[17]。此外，维生素D信号还可通过上调Paneth细胞分泌防御素来平衡肠道的固有免疫[9]。Kong等[11]的动物模型表明，维生素D可通过上调胆汁酸协同转运蛋白，来改善胆汁酸代谢、抑制肝脏脂肪和炎症。而Zhu等[12]发现长期维生素D缺乏可引起慢性炎症，诱导肝细胞凋亡和肝纤维化。大量流行病学研究也表明，维生素D缺乏与慢性肝病如脂肪肝、酒精性肝病等具有相关性，维生素D浓度会影响患者的炎症反应[18-19]，但关于维生素D与急性肝病如ALF之间的研究尚少。Dhaked等[20]发现，维生素D水平可以作为慢加ALT的预后指标。而Gomes等[13]的临床研究结果显示，低浓度的维生素D水平与ALF的严重程度之间存在显著相关性。
本研究首先借助D-GalN联合LPS诱导小鼠ALF模型，通过提前给予小鼠16周的维生素D缺乏饮食，探究了长期维生素D缺乏对ALF模型小鼠的影响。发现长期维生素D缺乏加重了模型小鼠的肝损伤、上调了肝脏炎症因子的表达，并增加了小鼠肝脏枯否细胞的数目，而成熟的枯否细胞可促进溶解反应增加肝脏组织坏死[21]。这表明，长期维生素D缺乏会增加小鼠对急性肝损伤的敏感性，加重肝损伤。这与本课题组前期在代谢综合征、非酒精性脂肪肝模型小鼠的研究结果类似[10]。本研究又借助TAA诱导小鼠ALF模型，通过提前给予小鼠3周的维生素D缺乏饮食，探究了维生素D缺乏对ALF小鼠存活率的影响。结果显示，维生素D缺乏明显降低了ALF小鼠的存活率。这表明，维生素D缺乏会加重肝损伤药物导致的ALF，降低存活率。所以本研究又通过提前一周给小鼠补充IU/g的维生素D2注射液，来探究补充高剂量维生素D对ALF模型小鼠的保护作用，发现提前补充维生素D降低了小鼠血清AST、ALT水平，显著减轻了模型小鼠的肝损伤和坏死程度，同时，补充维生素D还抑制了肝脏促炎因子如TNF-α、IL-1、CXCL2等的表达，这与Bi等[22]对肝干细胞在ALT模型小鼠中的研究结果类似。以上结果证实，补充维生素D可在一定程度上预防、保护急性肝损伤。其作用机制考虑为维生素D通过调节免疫反应如抑制肝脏枯否细胞的数目来下调下游炎症信号，进而减轻肝脏细胞的损伤和坏死，阻止并改善ALF的发生和发展。
本研究结果显示，维生素D对ALF模型小鼠具有一定的保护作用。由于维生素D缺乏在全球范围普遍存在[23]，而补充维生素D也方便易行，所以维生素D有望成为预防/治疗ALF的一个新选择。但本研究仅仅发现维生素D对药物诱导的ALF小鼠具有一定保护作用，并且是一个初步结果，对其中的机制还不清楚。所以将来还需通过研究维生素D对更多的ALF模型、甚至对临床患者的预防/治疗效果来进一步探索具体机制和用药可能。
参考文献
[1]段钟平.防微杜渐,
